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γ-谷氨酰转肽酶(γ-GT)活性测试盒 BES-BK2740B

γ-谷氨酰转肽酶(γ-GT)活性测试盒

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γ-谷氨酰转肽酶(γ-GT)活性测试盒

注意:正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

测定意义

γ-GT 是γ-谷氨酰循环中的关键酶,催化 GSH 降解。γ-GT 催化 GSH 或者其他γ-谷氨酰基化合物上的γ-谷氨酰基转移到受体。也可以催化 GSH 和其他γ-谷氨酰基化合物的水解,产生谷氨酸盐,在细胞外谷胱甘肽新陈代谢中起了重要的作用。

测定原理

γ-GT 催化谷氨酰对硝基苯胺中γ-谷氨酰基转移给 N-甘氨酰甘氨酸,生成对硝基苯胺,在405nm 有特征光吸收;通过测定 405nm 光吸收增加速率,来计算γ-GT 酶活性。

自备仪器和用品

可见分光光度计、低温离心机、水浴锅、可调节移液器、1mL 玻璃比色皿和蒸馏水

试剂组成和配制

试剂一:液体 50mL×1 瓶,4℃保存。

试剂二:粉剂×1 瓶,4℃保存。

试剂三:液体 10mL×1 瓶,4℃保存。

试剂四:液体 37mL×1 瓶,4℃保存。

工作液(在试剂二瓶中配制):临用前配制,把试剂三倒入试剂二瓶中,充分溶解(室温过低时可以 40℃水浴促进溶解);然后把试剂四倒入试剂二瓶中,混匀后室温保存。

粗酶液提取

1. 组织:按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 试剂一)进行冰浴匀浆。8000g,4℃离心 15min,取上清,置冰上待测。

2. 细菌、真菌:按照细胞数量(104个):试剂一体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细胞加入 1mL 试剂一),冰浴超声波破碎细胞(功率 300w,超声 3 秒,间隔 7秒,总时间 3min);然后 8000g,4℃,离心 15min,取上清置于冰上待测。

3. 血清等液体:直接测定。

γ-GT 测定操作

1. 分光光度计预热 30min,调节波长到 405 nm,蒸馏水调零。

2. 试剂二置于 25℃(一般物种)或者 37℃(哺乳动物)水浴中预热 30min(保证无沉淀)。

3. 测定管:取 1mL 玻璃比色皿,依次加入 100μL 上清液,900μL 工作液,混匀后于 405nm测定 10 s 和 70 s 时吸光度,记为 A1 和 A2。

γ-GT 活性计算公式

标准曲线:y=0.006x+0.0016,x 为对硝基苯胺浓度,y 为吸光值,R2=0.999。

(1). 按蛋白浓度计算

活性单位定义:25℃或者 37℃中,每毫克蛋白每分钟催化产生 1μmol 对硝基苯胺为 1 个酶活单位。

γ-GT(μmol/min/mg prot)=[ (A2-A1)-0.0016]÷0.006×V 反总÷(Cpr×V 样)÷T=1.67 × [ (A2-A1)-0.0016] ÷ Cpr

(2). 按样本质量计算

活性单位定义:25℃或者 37℃中,每克样本每分钟催化产生 1μmol 对硝基苯胺为 1 个酶活单位。

γ-GT(μmol/min/g 鲜重)=[ (A2-A1)-0.0016]÷0.006×V 反总÷(W×V 样÷V 样总)÷T=1.67 × [ (A2-A1)-0.0016] ÷W

(3)按细胞数量计算

活性单位定义:25℃或者 37℃中,每 104个细胞每分钟催化产生 1μmol 对硝基苯胺为 1 个酶活单位。

γ-GT(μmol/min/104 cell)=[ (A2-A1)-0.0016]÷0.006×V 反总÷(细胞数量×V 样÷V 样总)÷T=1.67 × [ (A2-A1)-0.0016] ÷细胞数量

(4)按液体体积计算

活性单位定义:25℃或者 37℃中,每毫升液体每分钟催化产生 1μmol 对硝基苯胺为 1 个酶活单位。

γ-GT(μmol/min/mL)= [ (A2-A1)-0.0016]÷0.006×V 反总÷V 样÷T= 1.67 × [ (A2-A1)-0.0016]V 反总:反应体系总体积(L),1000μL=0.001 L;Cpr:蛋白浓度(mg/mL);V 样:反应体系中加入上清液体积(mL),100μL=0.1 mL;V 样总:加入提取液体积,1mL;W,样本质量,g;T:反应时间(min),1min。

注意事项:

1. 培养细胞中γ-GT 活性测定时,细胞数目须在 300 万-500 万之间,细胞中γ-GT 的提取时可加试剂一后研磨或超声波处理,不能用细胞裂解液处理细胞(防止因为蛋白质变性导致酶失活)。

2. 配置好的工作液 2 周内使用完毕。


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