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谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)测试盒 BES-BK2741B

谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)测试盒

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谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)测试盒

注意:正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

测定意义:

GSH-Px 是谷胱甘肽氧化还原循环中催化还原型谷胱甘肽(GSH)氧化的主要酶之一。GSH-Px不仅能够特异地催化还原型谷胱甘肽与 ROS 反应,生成氧化型谷胱甘肽 GSSG,从而保护生物膜免受 ROS 的损害,维持细胞的正常功能;而且具有保护肝脏、提高机体免疫力、拮抗有害金属离子对机体的伤害和增加机体抗辐射等能力。

测定原理:

GSH-Px 催化有机过氧化物氧化 GSH,产生 GSSG;谷胱甘肽还原酶(GR)催化 NADPH 还原 GSSG,再生 GSH,同时 NADPH 氧化生成 NADP+;NADPH 在 340 nm 有特征吸收峰,而 NADP+没有;通过测定 340 nm 光吸收减少速率来计算 GSH-Px 活性。

自备仪器和用品:

紫外分光光度计、低温离心机、水浴锅、可调节移液器、1mL 石英比色皿和蒸馏水。

试剂组成和配置:

试剂一:液体 100mL×1 瓶,室温保存。

试剂二:粉剂×2 瓶,4℃保存。

试剂三:液体 10μL×2 支,-20℃保存。

试剂四:液体 200μL×1 瓶,4℃保存。

粗酶液提取:

1. 组织:按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 试剂一)进行冰浴匀浆。8000g,4℃离心 10min,取上清置冰上待测。

2. 细菌、真菌:按照细胞数量(104 个):试剂一体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细胞加入 1mL 试剂一),冰浴超声波破碎细胞(功率 300w,超声 3 秒,间隔 7秒,总时间 3min);然后 8000g,4℃,离心 10min,取上清置于冰上待测。

3. 血清等液体:直接测定。

测定操作:

1. 分光光度计预热 30 min,调节波长到 340 nm,蒸馏水调零。

2. 混合试剂在 25℃或者 37℃(哺乳动物)水浴中预热 30min。

3. 混合试剂配制:临用前,取试剂二一瓶,加入试剂一 20 mL,充分震荡溶解后,取少量混合液于一瓶试剂三中,充分混匀后再转移回试剂二中,混匀待用。(注意:必须现配现用,当天使用完)

4.试剂四的稀释: 吸取 21.5μL 试剂四,加入 5mL 水充分混匀,临用前配制,配制好的试剂当天使用。

5. 测定管:依次在 1mL 石英比色皿中加入 100μL 上清液、800μL 预热的混合试剂、100μL稀释后的试剂四, 迅速混匀后于 340nm 处测定第 30 s 和第 210s 的吸光值,分别记为 A1和 A2,△A= A1﹣A2。

计算公式:

(1). 按蛋白浓度计算

GSH-Px 活力单位定义:一定温度中,每 mg 蛋白每分钟催化 1nmol NADPH 氧化为 1 个酶活单位。

GSH-Px (nmol/min/mg prot)=[△A÷ε÷d×V 反总×109]÷(Cpr×V 样)÷T=536×△A÷Cpr

(2). 按样本质量计算

GSH-Px 活力单位定义:一定温度中,每 g 样本每分钟催化 1nmol NADPH 氧化为 1 个酶活单位。

GSH-Px (nmol/min/g)=[△A÷ε÷d×V 反总×109]÷(W×V 样÷V 样总)÷T=536×△A÷W

(3)按细胞数量计算

活性单位定义:一定温度中,每 104 个细胞每分钟催化 1nmol NADPH 氧化为 1 个酶活单位。

GSH-Px (nmol/min/104 cell)= [△A÷ε÷d×V 反总×109]÷(细胞数量×V 样÷V 样总)÷T=536×△A÷细胞数量

(4)按液体体积计算

活性单位定义:一定温度中,每毫升液体每分钟催化 1nmol NADPH 氧化为 1 个酶活单位。

GSH-Px (nmol/min/mL)=[△A÷ε÷d×V 反总×109]÷V 样÷T=536×△Aε:NADPH 摩尔消光系数 6.22×103L/mol/cm;V 反总:反应体系总体积,1000μL=0.001 L;106:1mol=1×106μmol; Cpr:上清液蛋白浓度(mg/mL);V 样:加入反应体系中上清液体积,100μL =0.1 mL;V 样总:加入提取液体积,1mL;W,样本质量,g;T:反应时间,3min。

注意事项:

(1)样品处理等过程均需要在冰上进行,且须在当日测定酶活力;

(2)混合试剂和底物液须临用前配制,配完后置于冰上,当天使用完;

(3)测定过程操作须迅速;

(4)细胞中 GSH-Px 活性测定时,细胞数目须在 300 万-500 万之间,细胞中 GSH-Px 的提取时可加试剂一后研磨或超声波处理,不能用细胞裂解液处理细胞。


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