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硫氧还蛋白过氧化物酶(TPX)测试盒 BES-BK2742B

硫氧还蛋白过氧化物酶(TPX)测试盒

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硫氧还蛋白过氧化物酶(TPX)测试盒

注意:正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

测定意义:

TPX 属于过氧化物酶家族,在体内主要通过还原过氧化氢和一些氢过氧化物来实现抗氧化作用,功能与 GPX 类似,也是谷胱甘肽氧化还原循环关键酶之一。TPX 普遍存在于各种生物体内,如酵母、植物、动物、原生动物、寄生虫、细菌和古细菌,在进化上高度保守。TPX 与细胞增殖、分化、细胞凋亡及肿瘤发生调控密切相关。TPX 的主要功能包括细胞脱毒、抗氧化和调节由过氧化氢介导的信号转导和免疫反应。

测定原理:

TPX 催化 H2O2氧化二硫苏糖醇(DTT),H2O2的吸收波长为 240nm,通过测定 240nm 吸光度的下降速率,即可计算出 TPX 活性。

自备仪器和用品:

紫外分光光度计、低温离心机、水浴锅、可调节移液器、1mL 石英比色皿和蒸馏水

试剂组成和配制:

试剂一:液体 50mL×1 瓶,室温保存。

试剂二:液体 50mL×1 瓶,- 20℃保存。

试剂三:液体 5mL×1 瓶,4℃。

粗酶液提取:

1. 组织:按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 试剂一)进行冰浴匀浆。8000g,4℃离心 10min,取上清置冰上待测。

2. 细菌、真菌:按照细胞数量(104个):试剂一体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细胞加入 1mL 试剂一),冰浴超声波破碎细胞(功率 300w,超声 3 秒,间隔 7秒,总时间 3min);然后 8000g,4℃,离心 10min,取上清置于冰上待测。

3. 血清等液体:直接测定。

TPX 测定操作:

1. 分光光度计预热 30min,调节波长到 240 nm,蒸馏水调零。

2.试剂二置于 25℃(一般物种)或者 37℃(哺乳动物)水浴预热 30 min。

3.取 1mL 石英比色皿,加入 20 μ L 上清液,900 μ L 试剂二,80 μ L 试剂三,迅速混匀后于240 nm 测定 10 s 和 130 s 吸光度,记为 A1 和 A2。

TPX 活性计算公式:

(1). 按蛋白浓度计算

活性单位定义:25℃或者 37℃中,每毫克蛋白每分钟催化 1nmol H2O2降解为 1 个酶活单位。

TPX 活性(nmol/min /mg prot)=(A1-A2)÷ε÷d×V 反总÷(Cpr×V 样)÷T=573×(A1-A2)÷Cpr

(2). 按样本质量计算

活性单位定义:25℃或者 37℃中,每克样本每分钟催化 1nmol H2O2降解为 1 个酶活单位。

TPX 活性(nmol/min/g 鲜重)=(A1-A2)÷ε÷d×V 反总÷(W×V 样÷V 样总)÷T=573×(A1-A2)÷W

(3)按细胞数量计算

活性单位定义:25℃或者 37℃中,每 104个细胞每分钟催化 1nmol H2O2降解为 1 个酶活单位。

TPX 活性(nmol/min/104 cell)=(A1-A2)÷ε÷d×V 反总÷(细胞数量×V 样÷V 样总)÷T=573×(A1-A2)÷细胞数量

(4)按液体体积计算

活性单位定义:25℃或者 37℃中,每毫升液体每分钟催化 1nmol H2O2降解为 1 个酶活单位。

TPX 活性(nmol/min /mL)=(A1-A2)÷ε÷d×V 反总÷V 样÷T=573×(A1-A2)ε:H2O2的摩尔消光系数,43600 L/mol/cm=0.0436 L/μmol/cm;d:比色皿光径,1cm;V 反总:反应体系总体积(L),1000 μ L=0.001 L;Cpr:上清液蛋白质浓度(mg/mL);V 样:加入反应体系中上清液体积(mL),20 μ L=0.02 mL;V 样总:加入提取液体积,1mL;W,样本质量,g;T:反应时间(min),2min。


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