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谷胱甘肽S-转移酶(GST)测试盒 BES-BK2743B

谷胱甘肽S-转移酶(GST)测试盒

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谷胱甘肽S-转移酶(GST)测试盒

注意:正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

测定意义:

GST 是一种具有多种生理功能的蛋白质家族,主要存在于细胞质内。GST 是体内解毒酶系统的重要组成部分,主要催化各种化学物质及其代谢产物与 GSH 的巯基共价结合,使亲电化合物变为亲水物质,易于从胆汁或尿液中排泄,达到将体内各种潜在或具备毒性的物质降解并排出体外的目的。因此,GST 在保护细胞免受亲电子化合物的损伤中发挥着重要的生物学功能。此外,因为 GST 具有 GSH-Px 活性,亦称为 non-Se GSH-Px,具有修复氧化破坏的大分子如 DNA、蛋白质等的功能。注意,GST 催化的反应减少 GSH 含量,但是不增加GSSG 含量。

测定原理:

GST 催化 GSH 与 CDNB 结合,其结合产物的光吸收峰波长为 340nm;通过测定 340nm 波长处吸光度上升速率,即可计算出 GST 活性。

自备仪器和用品:

紫外分光光度计、低温离心机、水浴锅、可调节移液器、1mL 石英比色皿和蒸馏水。

试剂组成和配置:

试剂一:液体 50mL×1 瓶,4℃保存。

试剂二:液体 45mL×1 瓶,4℃保存。

试剂三:粉剂×1 瓶,4℃保存。临用前加 5 mL 蒸馏水溶解。

粗酶液提取:

1. 组织:按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 试剂一)进行冰浴匀浆。8000g,4℃离心 10min,取上清置冰上待测。

2. 细菌、真菌:按照细胞数量(104个):试剂一体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细胞加入 1mL 试剂一),冰浴超声波破碎细胞(功率 300w,超声 3 秒,间隔 7秒,总时间 3min);然后 8000g,4℃,离心 10min,取上清置于冰上待测。

3. 血清等液体:直接测定。

测定操作:

1. 分光光度计预热 30 min,调节波长到 340 nm,用蒸馏水调零。

2. 试剂三放在 25℃(一般物种)或者 37℃(哺乳动物)保温。

3. 测定管:取 1mL 石英比色皿,加入 100μL 上清液,900μL 试剂二和 100μL 试剂三,迅速混匀后于 340nm 测定吸光度变化,记录 10 s 和 310 s 吸光度为 A1 和 A2。

GST 活性计算公式:

(1). 按蛋白浓度计算

活性单位定义:在 25℃或者 37℃中,每毫克蛋白每分钟催化 1nmol/L CDNB 与 GSH 结合为1 个酶活单位。

GST(nmol/min/mg prot)=(A2-A1))÷ε÷d×109×V 反总÷(Cpr×V 样)÷T=230×((A2-A1) ÷Cpr

(2). 按样本质量计算

活性单位定义:在 25℃或者 37℃中,每克样品每分钟催化 1nmol/L CDNB 与 GSH 结合为 1个酶活单位。

GST(nmol/min/g 鲜重)=(A2-A1)÷ε÷d×109×V 反总÷(W×V 样÷V 样总)÷T=230×(A2-A1) ÷W

(3)按细胞数量计算

活性单位定义:在 25℃或者 37℃中,每 104个细胞每分钟催化 1nmol/L CDNB 与 GSH 结合为 1 个酶活单位。

GST(nmol/min/104 cell)=(A2-A1)÷ε÷d×109×V 反总÷(细胞数量×V 样÷V 样总)÷T=230×(A2-A1) ÷细胞数量

(4)按液体体积计算

活性单位定义:在 25℃或者 37℃中,每毫升液体每分钟催化 1nmol/L CDNB 与 GSH 结合为1 个酶活单位。

GST(nmol/min/mL)=(A2-A1)÷ε÷d×109×V 反总÷V 样÷T= 230×(A2-A1)ε:产物摩尔消光系数,9.6×103 L/mol /cm;d:比色皿光径,1cm;106:1mol=1×106μmol;V 反总:反应体系总体积,1100μL=0.0011 L;Cpr:上清液蛋白质浓度(mg/mL),需要另外测定,建议选用本公司生产的 BCA 蛋白质浓度测定试剂盒;V 样:加入反应体系中上清液体积,100μL=0.1 mL;V 样总:加入提取液体积,1mL;W,样本质量,g;T:反应时间(min),5min。

注意事项:

1. 样品处理等过程均需要在冰上进行,且须在当日测定酶活力;

2. 细胞中 GST 活性测定时,细胞数目须在 300 万-500 万之间,细胞中 GST 的提取时可加试剂一后研磨或超声波处理,不能用细胞裂解液处理细胞;

3. 本法测定 GST 活性的线性范围可达 76 μmol/min /L,测定前先用 1~2 个样做预实验,如5min 内反应不成线性,须对样品用蒸馏水稀释,计算结果乘以稀释倍数;

4. 测定反映的温度对测定结果有影响,请控制在 25℃或者 37℃(哺乳动物)。


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