苹果酸合酶（MS）测试盒

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

苹果酸合酶（MS，EC 4.1.3.2）是属于转移酶中酰基转移酶的一类，主要存在于植物和微生物中。MS 是乙醛酸循环的关键酶之一，在 MS 催化下乙醛酸与乙酰辅酶 A 反应生成苹果酸。

测定原理：

MS 催化乙酰 CoA 和乙醛酸产生苹果酸，同时生成辅酶 A，辅酶 A 使无色的 DTNB 转变成黄色的 TNB，在 412nm 处有特征吸光值。

需自备的仪器和用品：

酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、96 孔板、研钵、冰、和蒸馏水试剂组成和配制：

试剂一：液体 120 mL×1 瓶，4℃保存；

试剂二：液体 10 mL×1 瓶，4℃保存；

试剂三：粉剂×1 瓶，-20℃保存；临用前加入 10mL 试剂一充分溶解后使用，用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；

试剂四：粉剂×1 瓶，4℃保存；临用前加入 2.4mL 试剂一充分溶解后使用，用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；

样本的前处理：

1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104 个）：试剂一体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL试剂一），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30次）；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

2、组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 试剂一），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

测定步骤：

1、酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 412nm。

2、样本测定在 96 孔板中依次加入 20μL 样本、80μL 试剂二，80μL 试剂三和 20μL 试剂四，混匀，立即记录 412 nm 处反应 5min 时的吸光值 A1 和 10min 时的吸光值 A2，计算 ΔA=A2-A1。

MS 活性计算：

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟催化产生 1 nmol TNB 定义为一个酶活力单位。

MS（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=294×ΔA÷Cpr此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

（2）按样本鲜重计算：

单位的定义：每 g 组织每分钟催化产生 1 nmol TNB 定义为一个酶活力单位。

MS（nmol/min /g 鲜重）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷（W ×V 样÷V 样总）÷T=294×ΔA÷W

（3）按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟催化产生 1 nmol TNB 定义为一个酶活力单位。

MS（nmol/min /104 cell）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷（500×V 样÷V 样总）÷T=0.588×ΔAV 反总：反应体系总体积，2×10-4 L；ε：TNB 摩尔消光系数，1.36×104 L / mol /cm；d：96孔板光径，0.5cm；V 样：加入样本体积，0.02 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500 万。