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组织细胞 辅酶Ⅱ（NADP+/NADPH）检测试剂盒(WST-8法)
产品说明：
NADP/NADPH检测试剂盒（NADP/NADPH Assay Kit）是一种特异灵敏的检测总烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP）或还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）的试剂盒。NADP在细胞内以两种化学型存在，NADP+是氧化型，NADPH是还原型。在氧化还原反应中，NADP+作为氢和电子的受体，NADPH作为氢和电子的供体，在糖酵解等生理过程中发挥重要作用。
本试剂盒利用NADPH与CCK-8试剂反应生成NADP+和甲赞(Formazan)，通过测定甲赞450nm吸光度定量测定NADPH浓度。在该检测反应中，同时加入葡萄糖-6-磷酸（Glucose-6-phosphate, G-6-P）和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（Glucose-6-phosphate dehydrogenase, GDH），可以将生成的NADP+还原为NADPH，使检测反应成为循环反应，在G-6-P、CCK-8和GDH过量的条件下，生成的甲赞与NADP+和NADPH总量（NADP）成正相关，从而定量检测NADP浓度。在样本经过加热分解NADP+后，可以定量检测NADPH浓度。
检测反应示意图如下：
本试剂盒具有良好的检测线性，检测NADP/NADPH的线性范围为0.078-5μM，灵敏度≤0.078μM。
本试剂盒能够检测细胞培养上清、细胞裂解上清、组织裂解上清、血浆和血清中的NADP/NADPH。
试剂盒组成
组份名称 | 规格 | 数量 | 储存 |
Lysis Buffer | 50ml/瓶 | 1 | -20℃ |
NADP/NADPH Assay Buffer | 5 ml/瓶 | 1 | -20℃ |
G-6-P Solution | 0.6 ml/管 | 1 | -20℃ |
GDH Solution | 60 μl/管 | 1 | -20℃ |
CCK-8 Solution | 1 ml/管 | 1 | -20℃ |
NADPH Standard (1mM) | 250 μl/管 | 1 | -80℃ |
储存条件
干冰运输，收到试剂盒后按将试剂盒不同组分按上述温度储存，有效期12个月。
注意事项
1. 每次测定时利用标准品制作标准曲线。
2. 实验过程中，除裂解液和检测缓冲液外，其它试剂请置于冰上。
3. 本产品仅限专业人员用于科学研究，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品。
测定前准备
1. 样品的准备
1.1 细胞裂解上清的准备：将需要测定的细胞(1×106-1×107)收集到2ml的离心管中，4℃、300g离心5分钟，弃去上清，然后加入200μl的Lysis Buffer，冰浴裂解30min，4℃、10000g离心10分钟，收集上清。
1.2 组织裂解上清的准备：将需要测定的组织(20-50mg)收集到玻璃匀浆器或自动匀浆管中，然后加入0.5ml的Lysis Buffer，匀浆1min，4℃、10000g离心10分钟，收集上清。
1.3 NADPH测定样品的准备：将上述样本，60℃孵育30min，使NADP+分解后，用于NADPH测定。
2. 试剂盒的准备
NADP/NADPH检测工作液的配制：根据待测样品数参考下表配制适当量的NADP/NADPH检测工作
液，表中试剂按比例混合后即为NADP/NADPH检测工作液。
1个样品 | 10个样品 | 50个样品 | |
NADP/NADPH Assay Buffer | 34.5 μl | 0.345 ml | 1.725 ml |
G-6-P Solution | 5 μl | 50 μl | 250 μl |
GDH Solution | 0.5 μl | 5 μl | 25 μl |
CCK-8 Solution | 10 μl | 100 μl | 500 μl |
3. 标准品的准备
在1.5 ml离心管中，加入995μl纯水或Lysis Buffer，再取5μl的1mM浓度NADPH标准品加入离心管中配制5μM浓度NADPH标准品；然后取另外6根1.5 ml离心管，分别加入500μl或Lysis Buffer，再吸取500μl的5μM浓度NADPH标准品依次倍倍稀释为2.5、1.25、0.625、0.312、0.156、0.078μM浓度。
测定方法
1. 参考下表，使用透明96孔板，依次加入标准品或样品、NADP/NADPH检测工作液，混匀，室温孵育10-20分钟。
空白对照孔 | 标准曲线孔 | 样品孔 | |
纯水或Lysis Buffer | 50 μl | ─ | ─ |
NADPH标准品 | ─ | 50 μl | ─ |
样品 | ─ | ─ | 50 μl |
NADP/NADPH检测工作液 | 50 μl | 50 μl | 50 μl |
2. 待反应完成后，利用酶标仪测定相对发光强度450nm波长的吸光度，如果样本中NADP/NADPH浓度偏低，可以适当延长反应时间。