丙酮酸羧化酶试剂盒

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase，PC，EC 6.4.1.1)广泛存在于动物、霉菌和酵母的线粒体中，催化丙酮酸、ATP、CO2和水生成草酰乙酸、ADP 和 Pi，是糖异生过程的第一个限速酶，在保证血糖的动态平衡方面起着重要的作用。

测定原理：

PC 催化丙酮酸、ATP、CO2和水生成草酰乙酸、ADP 和 Pi，苹果酸脱氢酶进一步催化草酰乙酸和 NADH 生成苹果酸和 NAD+，在 340nm 下测定 NADH 氧化速率，即可反映 PC 活性。

需自备的仪器和用品：

分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制：

提取液：100mL×1 瓶，4℃保存；

试剂一：液体 18 mL×1 瓶， 4℃保存；

试剂二：液体 13uL×1 支，4℃保存；

试剂三：粉剂×1 支，-20℃保存；

试剂四：粉剂×1 支，-20℃保存；

样本的前处理

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：

1、 称取约 0.1g 组织或收集 500 万细菌或细胞，加入 1mL 提取液，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

2、 将匀浆 600g，4℃离心 5min。

3、 弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心 10min。

4、 上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的 PC（此步可选做）。

5、 在步骤④的沉淀中加入 1mL 提取液，超声波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3秒，间隔 10 秒，重复 30 次），用于线粒体 PC 活性测定。

测定步骤：

1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。工作液的配制：临用前将试剂二和试剂三转移到试剂一中混合溶解待用；置于 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)预热 5 分钟；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。试剂四的配制：在试剂四瓶中加入 1mL 蒸馏水充分溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

2、 在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μL 样本、10μL 试剂四和 180μL 工作液，立即混匀，记录 340nm 处初始吸光值 A1 和 2min 后的吸光值 A2，计算 ΔA=A1-A2。注意：在该试剂盒中，若 ΔA 大于 0.5，需将样本用提取液稀释适当倍数后测定，使 ΔA 小于 0.5 可提高检测灵敏度。计算公式中乘以相应稀释倍数。

PC 活性计算：

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下

（1）按样本蛋白浓度计算

单位定义：每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

PC（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=1608×ΔA÷Cpr

（2）按样本鲜重计算

单位定义：每 g 组织每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

PC（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(W ×V 样÷V 样总)÷T=1608×ΔA÷W

（3）按细菌或细胞密度计算：

单位定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

PC（nmol/min/104cell）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(500×V 样÷V 样总)÷T=3.215×ΔAV 反总：反应体系总体积，2×10-4L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×103L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，2 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。

b.用 96 孔板测定的计算公式如下

（1）按样本蛋白浓度计算

单位定义：每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

PC（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=3216×ΔA÷Cpr

（2）按样本鲜重计算

单位定义：每 g 组织每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

PC（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(W ×V 样÷V 样总)÷T=3216×ΔA÷W

（3）按细菌或细胞密度计算：

单位定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

PC（nmol/min/104cell）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(500×V 样÷V 样总)÷T=6.43×ΔAV 反总：反应体系总体积，2×10-4L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×103L / mol /cm；d：96 孔板光径，0.5cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，2 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。