BCA蛋白浓度测定试剂盒(BCA Protein Assay Kit)

试剂盒组分：

工作原理：

碱性条件下，蛋白将二价 Cu 离子还原为一价 Cu 离子，一价 Cu 离子与 BCA试剂形成紫颜色的络合物，吸光度强度与蛋白浓度程正比。测定其在 562nm处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算出待测液体的蛋白浓度。

试剂盒性能：

注意事项：

低温或长期保存，若发现 BCA 试剂中 A 或者 B 试剂有沉淀发生，请于 37°C恒温并搅拌促使其充分溶解，若发现细菌污染（如出现不可溶解的絮状物或沉淀）则应丢弃，避免对实验结果造成影响；
不受大部分样品中的化学物质的影响，可以兼容样品中 5%的 SDS，5%的Triton X-100，5%的 Tween 20/60/80 等；
每次测量蛋白浓度均应做标准曲线；
当试剂 A 或者 B 混合时出现浑浊，请充分混匀，浑浊即会消失；
需准备 37°C水浴或恒温箱、酶标仪或普通分光光度计，测定波长为 562nm（540-595nm 之间皆可）；
使用 BCA 蛋白测定法测定时颜色会随着时间的延长不断加深，并且显色反应的速度和温度有关，因此需要注意检测时需要保持定时和定温，以确保测量数值的精确；（37°C 30min/室温 2h）
实验操作规范，提高上样量的精确度。

使用方法：

配制 BSA 标准品
注：标准品稀释液为蛋白样品的溶解液，原则上蛋白样品的基质溶液应与稀释液保持一直，也可用 0.9%的 NaCl 或 0.01M PBS 进行稀释。先将标准品稀释至 2mg/ml（操作如：120ul BSA（5mg/ml）+180ul 稀释液
=300ul BSA 溶液（2mg/ml）
BSA 标准品配制可参考下表（微孔板检测，线性范围 20-2000ug/ml）
BSA 标准品配制可参考下表（试管法检测，线性范围 20-2000ug/ml）
配制 BCA 工作液
（1）配制 BCA 工作液
按照 50:1 的比例混合试剂 A 和试剂 B（A：50，B：1），充分混匀
（2）计算所需要的总 BCA 工作液体积
BCA 工作液体积=（标准品+待测样品）*重复孔数*每个样品所需 BCA 体积注意事项：试管法检测时每个样品加 2.0ml BCA 工作液，微孔板检测每个样品加 200ul BCA 工作液。

实验步骤：

试管法（样品：BCA 工作液=1:20）

各取 100ul 标准品梯度溶液和待测样品加入到反应管中；
每管加入 2.0ml 的 BCA 工作液，混匀，37°C孵育 30 分钟；
注意：也可室温孵育 2 小时，或 60°C孵育 30 分钟。BCA 检测蛋白浓度，延长孵育时间会加深颜色反应。升高温度会加快显色反应。但是温度升高和时间延长会降低检测下限，以及降低工作线性范围。
冷却至室温，在分光光度计上进行检测，设定波长为 562nm。用装满水的比色皿对仪器校零。然后在 10 分钟内完成对所有样品的判读。
注意：由于 BCA 反应无真正的反应终点，即时温度下降低至室温，生色反应还是会继续。但是，由于室温下生色比率相对很低，因此若是 10 分钟内能对所有样品进行 562nm 的吸光度测试，不会导致明显误差。
根据 BSA 标准品的吸光度（减去标准品中 0 值的 OD 值即为最终的读数），绘制标准曲线（蛋白浓度 ug/ml，为 x 值；吸光度 OD562nm 为 Y 值），依据标准曲线和样品的稀释倍数计算出样品中蛋白浓度。

微孔板法（样品：BCA 工作液=1:10）

如表，将 BSA 标准品（2mg/ml）添加入微孔板中，再用稀释液补足至 20ul；
取 20ul 样品加入反应孔中（建议未知样品，利用稀释液稀释几个梯度）；
将 BCA 工作液按照 200ul 孔加入各个反应孔中，封膜，放置合适环境进行反应（37°C或 60°C反应 30min；室温反应 2h）
冷却至室温，在酶标仪的 540～595nm 波长范围内检测吸光度，其中562nm 波长最佳；
根据 BSA 标准品的吸光度（减去标准品中 Blank 孔的 OD 值即为最终的读数）。绘制标准曲线（蛋白浓度 ug/ml，为 x 值；吸光度 OD562nm 为 Y 值），依据标准曲线和样品的稀释倍数计算出样品中蛋白浓度。

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