糖原合成酶（GCS）试剂盒

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

GCS（EC 2.4.1.11）催化 UDPG 和葡萄糖残基生成糖原和 UTP，以 α-1，4-糖苷键相连延长糖链，是肝和肌肉糖原合成酶的限速酶，是胰岛素作用的主要靶酶，对糖代谢的调节和血糖稳态的维持具有重要作用。

测定原理：

GCS 催化 UDPG 和葡萄糖残基生成糖原和 UDP，丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶进一步依次催化NADH 氧化生成 NAD+，在 340nm 下测定 NADH 下降速率，即可反映 GCS 活性。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1 mL 石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制：

提取液：60mL×1 瓶，4℃保存；

试剂一：液体 45 mL×1 瓶， 4℃保存；

试剂二：液体 5mL×1 瓶，4℃保存；

试剂三：液体 41μL×1 支，4℃保存；

试剂四：粉剂×1 支， -20℃保存；

试剂五：粉剂×1 瓶， -20℃保存；

样本的前处理：

按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

测定步骤：

1、 分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。

2、 工作液的配制：临用前将试剂三和试剂四转移到试剂一中混合溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

3、 试剂五的配制：临用前在试剂五瓶中加入 2.5mL 试剂二充分溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

4、 将工作液和试剂五置于 37℃预热 5 分钟。

5、 在 1mL 石英比色皿中加入 50μL 样本、50μL 试剂五和 900μL 工作液，立即混匀，记录340nm 处初始吸光值 A1 和 1min 后的吸光值 A2，计算 ΔA=A1-A2。

注意：在该试剂盒中，若 ΔA 大于 0.1，需将样本用提取液稀释适当倍数后测定，使 ΔA 小于 0.1 可提高检测灵敏度。计算公式中乘以相应稀释倍数。

GCS 活性计算：

（1）按样本蛋白浓度计算

单位定义：每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

GCS（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=3215×ΔA÷Cpr

（2）按样本鲜重计算

单位定义：每 g 组织每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

GCS（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(W ×V 样÷V 样总)÷T=3215×ΔA÷WV 反总：反应体系总体积，1×10-3L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×103L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.05 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，1 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g。