维生素B1测试盒

注意：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

测定意义

维生素 B1（Vitamin B1）是构成脱羧辅酶的主要成分，参与细胞代谢中的三羧酸循环，是维持机体正常代谢必须的水溶性维生素，在生物体能量代谢中有重要的作用。

测定原理

VB1 在碱性条件下还原铁氰化钾生成亚铁氰化钾，亚铁氰化钾与 Fe3+在弱酸条件下生成普鲁士蓝，在 704nm 有特征吸收峰。

自备实验用品及仪器

天平、研钵、离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板、恒温水浴锅、蒸馏水。

试剂组成和配制

提取液：液体 70mL×1 瓶，4℃保存。

试剂一：液体 1mL×1 瓶，4℃保存。

试剂二：液体 2mL×1 支，4℃保存。

试剂三：液体 2mL×1 瓶，4℃避光保存。

试剂四：液体 5mL×1 瓶，4℃保存。

试剂五：液体 3mL×1 瓶，4℃避光保存。

样本处理

1. 组织：将样品磨碎，按照质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约0.1g，加入 0.6mL 提取液）加入提取液，60℃浸提 30min，加蒸馏水 0.4mL，混匀后于25℃，16000rpm 离心 10min，取上清测定（动物组织等蛋白含量较高的样本建议离心20-30min）。

2. 细胞：按照细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500万细胞加入 0.6mL 提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；加蒸馏水 0.4mL，混匀后于 25℃，16000rpm 离心 10min，取上清测定。

3. 血清：直接测定。

测定操作

计算公式

a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下

标准曲线：y = 0.017x+0.0031，R2 = 0.9991；x 为标准品浓度：μg/mL；y 为△A（A 测定管-A 空白管）

1. 按照蛋白含量计算

VB1 含量（μg/mg prot）=（△A-0.0031）÷ 0.017÷Cpr = 58.8×（△A-0.0031）÷ Cpr

2. 按照样本质量计算

VB1 含量（μg/g 鲜重）=（△A-0.0031）÷ 0.017÷（W÷V 样总） = 58.8×（△A-0.0031）÷ W

3. 按照细胞数量计算

VB1 含量（μg/104cell）=（△A-0.0031）÷ 0.017÷（细胞数量÷V 样总） = 58.8×（△A-0.0031）÷ 细胞数量

4. 按照液体体积计算

VB1 含量（μg/mL）=（△A-0.0031）÷ 0.017 = 58.8×（△A-0.0031）V 样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g

b．用 96 孔板测定的计算公式如下

标准曲线：y = 0.0085x +0.0031，R2 = 0.9991；x 为标准品浓度：μg/mL；y 为△A（A 测定管-A 空白管）

1. 按照蛋白含量计算

VB1 含量（μg/mg prot）=（△A -0.0031）÷ 0.0085÷Cpr = 117.65×（△A-0.0031）÷ Cpr

2. 按照样本质量计算

VB1 含量（μg/g 鲜重）=（△A-0.0031））÷ 0.0085÷（W÷V 样总） = 117.65×（△A-0.0031）÷ W

3. 按照细胞数量计算

VB1 含量（μg/104cell）=（△A-0.0031）÷ 0.0085÷（细胞数量÷V 样总） = 117.65×（△A-0.0031）÷ 细胞数量

4. 按照液体体积计算

VB1 含量（μg/mL）=（△A-0.0031）÷ 0.0085 = 117.65×（△A-0.0031）V 样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g

注意事项

1. 若测定结果中吸光值超过 2，请将样本稀释后进行测定，并在计算公式中乘以稀释倍数。

2. 蛋白浓度较高的样品，比如动物组织，若显色完成后有沉淀产生，将样本稀释后再重新测定，并在计算公式中乘以稀释倍数。

3. 显色完成后立即进行测定。

4. 标准曲线线性范围为 0.1-10μg/mL。