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外泌体提取和RNA分离试剂盒（血清或血浆）
保存与应用
【保存条件】
本试剂盒 2-8℃下运输，室温或 2-8℃下保存至少十二个月，按照试剂盒不同成 分分别保存，使用前请详细阅读说明书，使用前需恢复室温并充分混匀。
【应用范围】
本产品只用于科学研究，不能用于临床诊断。
产品介绍
外泌体(Exosome)是由不同细胞分泌的直径 30-150nm 的胞外膜性囊泡 (Extracellular Vesicles，EVs）。外泌体普遍存在于多种体液中，其内容物丰富， 包括蛋白质、脂质和核酸等，在细胞间信息交流中发挥着重要作用，主要参与免 疫抗原呈递，神经递质传递，脂类代谢及细胞信号转导等过程，并与多种疾病的 发生、发展、治疗及预后密切相关。
研究表明，胞外膜性囊泡（包括外泌体）内容物中富含不同类型 RNA（mRNA 和 microRNA 等）。microRNA（miRNA）在基因转录和转录后调节方面起重要作 用，与疾病的发生、发展密切相关，因此，某些外泌体 miRNA（exo-miRNA)可 以作为疾病的新的治疗靶标和诊断生物标记物。
研发的外泌体提取和 RNA 分离试剂盒，能够简单、快速地捕获生 物样本中外泌体，并高效分离外泌体中的 RNA（包括 miRNA）。其主要原理是 依据外泌体的膜结构特点（脂质双分子层），设计和修饰特异结合外泌体的树脂， 通过与外泌体脂质双分子层组成成分结合，而几乎不与样本中其它蛋白质结合来 实现外泌体的提取和纯化，采用酚/胍盐方法提取已分离的外泌体中总 RNA（包 括 miRNA），利用核酸特异吸附柱，可方便、快捷地纯化外泌体 RNA，获得的 RNA 可直接用于下游应用，如 realtime RT-PCR，Northern blot，芯片表达谱分析， NGS 测序等。
试剂盒组成和说明
*使用前先在每瓶洗涤液 A （Wash Solution A）中加入 45ml 无水乙醇，混匀，并在瓶标签 上标记“√”，每次使用后立即盖紧瓶盖。
【注意事项】
各产品组分根据要求在合适的温度下保存，自购买之日起有效期至少半年。 试剂盒在使用前先恢复室温，裂解液 A 在使用前检查是否有盐沉淀，建议在 使用前 37℃水浴 10 分钟，混合均匀，无沉淀，溶液清澈。
本试剂盒只适用于血清或血浆样本。
本试剂盒每个反应是基于 0.5ml 血清或血浆作为起始体积，样本不足时，需要用无核酸酶水补充至 0.5ml ，但样本量不要低于 200μl。
本试剂盒所有离心均在室温下进行。
预防 RNase 污染，应注意以下几方面：
经常更换新手套，防止皮肤表面 RNase 污染。
使用无 RNase 的塑料制品和枪头避免交叉污染。
RNA 释放后在裂解液中不会被 RNase 降解，但提取后继续处理过程中应使 用不含 RNase 的塑料盒或玻璃器皿，玻璃器皿可在 150℃烘烤 4h，塑料器皿 可在 0.5M NaOH 中浸泡 10 min，然后用水彻底清洗，再灭菌，即可去除 RNase。
配制溶液应使用无 RNase 的水（将水加入到干净的玻璃瓶中，加入 DEPC 至 终浓度 0.1%（v/v），放置过夜，高压灭菌）。
6. 需要自备试剂：96-100% 乙醇。
操作方法
1. 样本预处理
对于冻存血清或血浆，室温或 25℃水浴解冻，将完全融化的样品置于冰上； 对于新鲜血清或血浆，收集样品后置于冰上，12,000×g，离心 15min，去除细胞 或细胞碎片，离心后将上清吸入新管中。
注意：试剂盒在使用前需恢复室温。
2. 纯化柱平衡
吸取 500μl 平衡缓冲液加入外泌体纯化柱中（已放入收集管），500×g 离心 2min，弃去滤液，外泌体纯化柱重新放入收集管中，待用。
3. 外泌体结合
吸取 500μl 处理的血清或血浆放入 5.0ml 离心管中（试剂盒不提供），加入 结合缓冲液 1.5ml，颠倒混匀后静置 2min，然后将混合液分 3 次（每次大约 700μl） 加入已平衡的外泌体纯化柱中（已放入收集管），500×g 离心 2min，每次倒掉滤 液。
4. 外泌体洗涤
吸取 0.5ml 洗涤缓冲液加入外泌体纯化柱中（已放入收集管），500×g 离心 2min，然后再 1,500×g 离心 4min，弃去滤液和收集管。
5. 外泌体 RNA 释放
注意：裂解液 A 在使用前应恢复室温，为了提高提取效率建议裂解液 A 使用前 37℃水浴 10 分钟后使用。
将外泌体纯化柱放入新的 2.0 ml 无 RNase 的离心管中（试剂盒不提供），加 入 600μl 裂解液 A，150×g 离心 2min，然后 5,000×g 离心 2min，弃外泌体纯 化柱，滤液涡旋震荡 30s，室温静置 5min，使得核酸蛋白复合物完全分离。
将得到的裂解产物加入 150μl 裂解液 B，盖好管盖，剧烈振荡 30sec，室温放 置 5min。室温 12,000×g 离心 15min，样品会分成三层：黄色的有机相，中 间层和无色的水相，RNA 主要在水相中（上层），把水相(避免吸取中间层) 转移到新的 1.5ml 无 RNase 离心管中（试剂盒不提供），进行下一步操作。
量取转移液的体积，缓慢加入 1.5 倍体积预冷的无水乙醇（如 400μl 的转移 液加 600μl 无水乙醇），颠倒混匀（此时可能会出现沉淀）后室温静置 5-10min。
6. 外泌体 RNA 结合
将得到的溶液和沉淀一起转入 RNA 吸附柱中（已放入收集管中），每次上 柱体积不得大于 700μl，可分 2 次完成，室温静置 2min，室温 8,000×g 离心 30sec， 离心后弃掉滤液，保留 RNA 吸附柱。
7. 外泌体 RNA 洗涤
向 RNA 吸附柱加入 500μl 洗涤液 A（请检查是否已加入指定量的无水乙醇）， 室温静置 2min，室温 8,000×g 离心 30sec，倒掉收集管中的滤液，将吸附柱放入 收集管中，重复洗涤 1 次。将空柱于室温 12,000×g 再离心 2min，去除残余液体。 打开 RNA 吸附柱盖子，将 RNA 吸附柱置于室温放置 5-10min，以彻底晾干吸附 材料中残余的洗涤液。 注意：这一步的目的是将吸附柱中的残余的洗涤液去除，洗涤液中的乙醇的残留会影响后 续的酶反应（酶切、PCR 等）实验。
8. 外泌体 RNA 洗脱
将 RNA 吸附柱转入新的无 RNase 的 1.5 ml 离心管中（试剂盒提供），向 RNA 吸附柱中间位置悬空滴加 50-200μl 洗脱液 A，室温放置 2min，室温 12,000×g 离心2min，离心得到的溶液再加入吸附柱中，室温放置2min，12,000×g离心2min， 最后离心管中液体为提取的外泌体RNA，可直接应用于下游实验或保存在-80℃。 注意：洗脱液体积不应小于 50μl，体积过小影响回收效率。洗脱液的 pH 对于洗脱效率有 很大影响，若用水做洗脱液应保证 pH 值在 7.0-8.5 范围内，pH 值低于 7.0 会降低洗脱效率， 且 RNA 产物最好立即使用，或保存在-80℃，以防止 RNA 降解。
用途：该产品仅供科研实验使用，未经允许不得用于其它用途！以实际收货产品说明书为准，网站说明书仅供参考。