外泌体表面修饰试剂盒（蛋白靶向） 

保存与应用 

【保存条件】 

干冰或冰袋运输，收到试剂盒后按不同组分分别在 2-8℃或-20℃下保存。有效期 6 个月， 使用前请详细阅读说明书。

【应用范围】

本产品只用于科学研究，不能用于临床诊断和治疗。

产品介绍

外泌体(Exosome)是由不同细胞分泌的直径 30-150nm 的胞外膜性囊泡。外泌体内容物丰 富，包括蛋白质、脂质和核酸等，在细胞间信息交流中发挥着重要作用，并与多种疾病的发 生、发展、治疗及预后密切相关。 

作为天然的胞间信息载体，外泌体免疫原性低，生物相容性高，在人体血液中比较稳定。 能够利用增强渗透滞留效应（Enhanced Permeation and Retention effect，EPR），有选择性的 渗透和滞留在肿瘤或炎症组织部位，可穿透血脑屏障等。不仅可以通过其内源内容物直接对 受体细胞进行治疗，也可以作为药物载体，递送化学药物、蛋白质、多肽及基因药物，在医 疗领域具有巨大的应用潜力。
为了增强外泌体的治疗效果，降低对正常细胞的毒害，需提高外泌体的靶向递送能力， 目前科研常用方法是基因改造分泌外泌体的细胞，利用重组克隆质粒，在细胞中表达靶向蛋 白或多肽-外泌体膜蛋白复合体，收集释放的外泌体，来获得靶向外泌体，但该方法修饰效 率低，且部分细胞转染困难，难以大规模制备。
本试剂盒避开繁琐的基因克隆步骤，通过点击化学反应，直接在提取的外泌体表面修饰 目标蛋白。首先将点击化学 linker A 分子共价偶联在外泌体表面，形成 exo-linker A，点击化 学 linker B 分子与靶向蛋白共价偶联，形成 pro-linkerB，各自纯化，去除剩余的 linker 分子。 然后将 exo-linker A 和 pro-linker B 孵育，两个 linker 之间发生快速高效的点击化学反应，以 共价键形式将目标蛋白偶联在外泌体表面，最后采用 SEC 分子排阻柱将剩余的 pro-linker B 去除，得到大量纯净的修饰外泌体。
本试剂盒表面修饰效率高，反应条件温和，生理条件下即可发生反应，反应特异性好， 无有害副产物，不需额外添加催化剂或其他化学物质，不会损伤外泌体膜结构，也不影响目 标蛋白的生物活性和功能，为靶向外泌体提供了一种高效、简便的修饰手段，可实现靶向外 泌体的大规模制备。

试剂盒组成和说明

注意：两种纯化柱内均含有保存液，请竖立保存。
需自备的试剂和设备
1. 二甲基亚砜（DMSO）
2. PBS 缓冲液（pH 7.2-7.6）
3. 目标蛋白（不低于 0.2mg/mL）
4. 0.22um 滤膜
5. 收集管（烧杯，2mL 和 mL 离心管）
6. 旋转混匀仪或震荡混匀仪
7. 恒温培养箱（37℃）

【注意事项】
1. 点击化学 linker A 和 linker B 易水解，使用前需室温放置 10 分钟，平衡至室温，避免冷 凝水凝结，使用后请立即盖好旋紧，用封口膜密封。
2. 外泌体和蛋白缓冲液中避免含有 Tris、甘氨酸等含有胺的物质。
3. 可以对任何来源的外泌体进行修饰，包括细胞培养液和体液(如，血清、血浆、尿液、 CSF 或唾液等) 提取的外泌体。
4. 不建议使用 PEG 沉淀法提取的外泌体，推荐使用超速离心法、亲和色谱法、SEC 分子 排阻色谱法或磁珠捕获等方法提取的外泌体。
5. 为达到较好的体内浓度和靶向效果，外泌体浓度不得低于 5×1010颗粒数/mL。
6. 目标蛋白浓度请勿低于 0.2mg/mL，外泌体修饰效率会随着蛋白浓度的减少而降低。
7. 本试剂盒为非无菌操作，在进行下游细胞实验或体内实验前，必须将修饰好的外泌体进 行 0.22um 滤膜过滤，以达到无菌状态。
8. 本试剂盒未开封前的有效期为 6 个月，请在有效期内使用。

操作方法
一、实验前准备
1. 冻干粉 linker A 和 linker B 溶解
将 linker A 和 linker B 置于室温中放置至少 10 分钟，充分平衡至室温。打开封口膜，在 每个管中加入 60µL 二甲基亚砜（DMSO），上下吹打使其充分混匀，制备成 5mM 的 linker A 和 linker B，盖好旋紧，等候下步使用。
2. 计算 5mM linker B 加入靶蛋白溶液中的量
每个反应中 linker B 的使用量，取决于目标蛋白的使用浓度。通常，linker B 和目标蛋 白的摩尔比为 5:1 时，能达到较理想的效果。 以浓度 1mg/mL 靶蛋白（分子量 Mr）为例，200µL 中加入 5mM linker B 的计算方法：
1）计算 1mg/mL 靶蛋白（分子量 Mr）的摩尔浓度(mM)： 1mg/mL Mr ×1000= mM
2）1mg/mL 靶蛋白，200µL，应加入 5mM 的 linker B 溶液体积： mM×51×200µL × 1 5mM= µL
计算示例：
1mg/mL 的 IgG（分子量 150KDa）溶液，200µL 中需加入 5mM linker B 的量为 1.33µL。
1）1mg/mL 150,000×1000= 0.00667mM
2）0.00667mM×51×200µL × 1 5mM=1.33µL
3. SuperEV 0.5 外泌体纯化柱和蛋白纯化柱室温平衡 从冰箱中取出 SuperEV 0.5 外泌体纯化柱和蛋白纯化柱，垂直固定，如果无合适的垂直固定装置，可从我公司购买配套的固定组件（货号：HCS1012），室温放置至少 30 分钟，使柱子充分平衡至室温。
注意：
柱子平衡至室温前，不要打开顶盖和底盖。
柱子第一次使用，上筛板与填料表面可能存在间隙，这是储存过程中填料沉降造成 的，不影响分离性能，实验前将筛板向下垂直推到填料表面即可。
二、外泌体偶联 linker A，靶向蛋白偶联 linker B
1. 外泌体偶联 linker A
取 600µL 外泌体至 2mL 离心管中，加入 2.4µL 反应增强液，吹打混匀，再加入 9.6µL 5mM 的 linker A，吹打混匀，置于旋转混匀仪或震荡混匀器上，室温震荡孵育 1.5 小时， 即得到 exo-linker A 反应物。

2. 蛋白偶联 linker B
根据靶向蛋白浓度，计算 5mM linker B 的加入量，使 linker B 与蛋白的分子摩尔比为 5:1。取 200µL 靶向蛋白（缓冲液最好为 PBS）至 2mL 离心管中，再加入 linker B，吹打混 匀，置于旋转混匀仪或震荡混匀器上，室温震荡孵育 1.5 小时，得到 pro-linker B 反应物。

三、exo-linker A 和 pro-linker B 的纯化
1. 纯化柱柱平衡（可在外泌体或靶向蛋白孵育 linker 时完成）
1）将收集管（烧杯或普通离心管）放置在 SuperEV 0.5 外泌体纯化柱和蛋白纯化柱下 方，打开顶盖，用移液器吸弃上方的保存液。
2）外泌体纯化柱取下底盖，分次共加入 20mL PBS 冲洗柱子。
3）蛋白纯化柱取下底盖，分次共加入 4mL PBS 冲洗柱子。
4）冲洗过程始终保持顶部筛板湿润，避免柱体变干。冲洗完成后，盖上底盖，加入少量 PBS 等待后续操作

2. exo-linker A 纯化（去除游离的 linker A 分子）
1）使用冲洗后的 SuperEV 0.5 纯化柱进行纯化，吸弃纯化柱筛板上方的 PBS，取下 柱子底盖，下方放置 5mL 离心管。
2）将 exo-linker A 反应物混匀，瞬时离心，使液体全部集中在管底。
3）在筛板上方加入全部的 exo-linker A 反应物（约 600µL），待样品全部进入筛板， 出口无液体流出时，加入 2.9mL PBS，当液体全部流出后，收集完毕。该馏分大约 3.5mL，不含外泌体，可直接丢弃。
4）继续加入 1.2mL PBS 洗脱，用 2mL 离心管收集馏分。待出口无液体流出时，该馏 分收集完毕。exo-linker A 集中在该馏分，可用于下步操作。
5）收集完毕后，用 20mL PBS 对柱体进行冲洗，冲洗后的柱子加入少量 PBS，盖上 底盖，等待后续操作。

3. pro-linker B 纯化（去除游离的 linker B 分子）
1）使用冲洗后的蛋白纯化柱进行纯化，吸弃纯化柱筛板上方的 PBS，取下柱子底盖， 下方放置 2mL 离心管。
2）将 pro-linker B 反应物混匀，瞬时离心，使液体全部集中在管底。
3）在筛板上方加入全部的 pro-linker B 反应物（约 200µL），待样品全部进入筛板， 出口无液体流出时，加入 550µL PBS。当液体全部流出后，收集完毕，该馏分大约 750µL，不含蛋白，可直接丢弃。
4）继续加入 300µL PBS 进行洗脱，用 2mL 离心管收集馏分。待出口无液体流出时， 该馏分收集完毕。pro-linker B 集中在该馏分，可用于下步操作。 5）收集完毕后，柱子可直接丢弃。

四、exo-linker A 和 pro-linker B 点击化学反应及纯化
1. exo-linker A 与 pro-linker B 点击化学反应 将 300µL 纯化 pro-linker B 加入到 1200µL 纯化 exo-linker A 中，吹打混匀， 37℃孵 育 30 分钟。

2. 纯化（去除未结合的 pro-linker B）
1） 使用上面冲洗后的 SuperEV 0.5 外泌体纯化柱进行纯化，步骤同前。
2） 吸弃纯化柱筛板上方的 PBS，取下柱子底盖，下方放置 5mL 离心管。
3） 将点击化学反应混合物混匀，瞬时离心，使液体全部集中在管底；
4） 在筛板上方加入 750µL 的点击化学反应混合物，待样品全部进入筛板，出口无液体 流出时，加入 2750µL PBS。液体全部流出后，收集完毕。该馏分大约 3.5mL，不 含外泌体，可直接丢弃；
5） 继续加入 1500µL PBS 进行洗脱，用 5mL 离心管收集馏分。待出口无液体流出时， 该馏分收集完毕。修饰的靶向外泌体收集在该馏分；
6） 收集完毕后，用 20mL PBS 对柱体进行冲洗；
7） 冲洗完毕后，继续将剩余的 750µL 的点击化学反应混合物加入纯化柱中，进行纯化， 步骤同 4）和 5）。
8） 收集完毕，柱子可直接丢弃。
9） 本试剂盒操作过程不是无菌操作，在进行下游细胞实验或体内实验前，必须将修饰 的外泌体进行 0.22um 滤膜过滤，以保证无菌。

用途：该产品仅供科研实验使用，未经允许不得用于其它用途！以实际收货产品说明书为准，网站说明书仅供参考。