果糖-1,6-二磷酸醛缩酶（FBA）测试盒

注意：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

测定意义

植物叶绿体中果糖 1,6-二磷酸醛缩酶是光合作用中参与 calvin 循环的重要酶。催化果糖 1,6-二磷酸和景天庚酮糖 1,7-二磷酸的合成反应，在各种逆境胁迫下表现不同的响应。

测定原理

果糖 1,6-二磷酸醛缩酶催化果糖 1,6-二磷酸生成 3-磷酸甘油醛和磷酸二羟丙酮，在磷酸丙糖异构酶和 α-磷酸甘油脱氢酶作用下催化 NADH 和磷酸二羟丙酮生成 NAD 和 α-磷酸甘油，340nm 处吸光值的变化可反映果糖 1,6-二磷酸醛缩酶活性的高低。

自备实验用品及仪器

天平、震荡仪、低温离心机、研钵、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板。

试剂组成和配制

提取液一：液体 100mL×1 瓶，4℃保存。

提取液二：液体 100mL×1 瓶，4℃保存。

试剂一：液体 10mL×1 瓶，4℃避光保存。

试剂二：粉剂×1 瓶，-20℃避光保存。临用前加 2mL 蒸馏水充分溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

试剂三：粉剂×1 瓶，-20℃避光保存。临用前加 2 mL 蒸馏水充分溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

试剂四：粉剂×1 瓶，-20℃避光保存。临用前加 2 mL 蒸馏水充分溶解；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

试剂五：液体 2mL×1 瓶，4℃避光保存。

酶液提取

①总 FBA 酶提取：建议称取约 0.1g 样本，加入 1mL 提取液一，冰浴匀浆后超声破碎（冰浴，200W，破碎 3s，间歇 7s，总时间 1min），然后 4℃，8000g 离心 10min，取上清测定。

②胞浆和叶绿体 FBA 酶的分离：按照植物组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5～10 的比例（建议称取约 0.1g 样本，加入 1mL 提取液一），冰浴匀浆后于 4℃，200g 离心 5min，弃沉淀，取上清在 4℃，8000g 离心 10min，取上清用于测定胞浆 FBA 酶活性，取沉淀加1mL 提取液二，震荡溶解后超声破碎（冰浴，200W，破碎 3s，间歇 7s，总时间 1min），然后 4℃，8000g 离心 10min，取上清测定叶绿体中 FBA 酶活性。

建议测定总 FBA 酶活性，按照步骤①提取粗酶液，若需要分别测定胞浆和叶绿体中的 FBA，则按照步骤②提取粗酶液。

测定操作

1. 紫外分光光度计/酶标仪预热 30min，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。

2. 取微量石英比色皿/96 孔板，依次加入 100μL 试剂一，20μL 试剂二，20μL 试剂三，20μL试剂四，20μL 试剂五，20μL 粗酶液，充分混匀，记录 340nm 处 10s 的吸光值 A1 和 310s的吸光值 A2，△A=A1-A2

计算公式

a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下

（1）按照样本蛋白浓度计算

酶活单位定义：每毫克组织蛋白每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。

FBA（nmol/min/mg prot）= ΔA÷（ε×d）×V 反总÷(V 样×Cpr) ÷T=321.54×ΔA÷Cpr（2）按照样本质量计算

酶活单位定义：每克组织每分消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。

FBA（nmol/min/g 鲜重）= ΔA÷（ε×d）×V 反总÷(W ×V 样÷V 样总) ÷T=321.54×ΔA÷W

（3）按照细胞数量计算

酶活单位定义：每 104 个细胞每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。

FBA（nmol/min/104 cell）= ΔA÷（ε×d）×V 反总÷(V 样×细胞数量÷V 样总) ÷T = 321.54×ΔA÷细胞数量

（4）按照液体体积计算

酶活单位定义：每毫升液体每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。

FBA（nmol/min/mL）= ΔA÷（ε×d）×V 反总÷V 样÷T=321.54×ΔAV 反总：反应体系总体积，0.2mL；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×103 L/mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.02mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g

b. 用 96 孔板测定的计算公式如下

（1）按照样本蛋白浓度计算

酶活单位定义：每毫克组织蛋白每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。

FBA（nmol/min/mg prot）= ΔA÷（ε×d）×V 反总÷(V 样×Cpr) ÷T= 643.08×ΔA÷Cpr（2）按照样本质量计算

酶活单位定义：每克组织每分消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。

FBA（nmol/min/g 鲜重）= ΔA÷（ε×d）×V 反总÷(W ×V 样÷V 样总) ÷T= 643.08×ΔA÷W

（3）按照细胞数量计算

酶活单位定义：每 104 个细胞每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。

FBA（nmol/min/104 cell）= ΔA÷（ε×d）×V 反总÷(V 样×细胞数量÷V 样总) ÷T = 643.08×ΔA÷细胞数量

（4）按照液体体积计算

酶活单位定义：每毫升液体每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。

FBA（nmol/min/mL）= ΔA÷（ε×d）×V 反总÷V 样÷T= 643.08×ΔAV 反总：反应体系总体积，0.2mL；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光径，0.5cm；V 样：加入样本体积，0.02mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g