NADPH-细胞色素C还原酶（NCR）测试盒

注意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义:

细胞色素P450酶是- -组 主要存在于肝脏的同工酶，在外源物质代谢中具有重要作用，尤其是药物和毒物的代谢。NCR作为P450酶系的重要一员， 催化氧化型P450还原再生。

测定原理:

NCR催化NADPH还原氧化型细胞色素C，还原型细胞色素C在550nm处有特征吸收峰;通过测定550nm吸光度的增加速率，来计算NCR活性。

自备仪器和用品:

普通离心机，超速离心机、可调式移液枪、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板和蒸馏水。

试剂组成和配置:

试剂一:粉剂x2 瓶，4'C保存。 临用前根据用量每瓶加100mL蒸馏水充分溶解。

试剂二:液体x1 瓶，4'C保存。

试剂三:粉剂x1管，-20C保存。临用前配制，加1.04 mL蒸馏水充分溶解，4C 保存。

试剂四:粉剂x1管，4'C保存。临用前配制，加1100 μL蒸馏水充分溶解，4C保存。

粗酶液提取:

1、除去细胞核和线粒体等:称约0.5g组织，加入4C预冷的1 mL试剂一，冰上充分研磨，10 000g 4"C离心30min，取. 上清液，转移到超速离心管中。

2、粗制微粒体: 4C，100 00g，离心60min,弃上清液。

3、除血红蛋白等杂质:向步骤2的沉淀中加1 mL试剂- -，盖紧后充分震荡溶解，100 000g离心30min,弃上清液。

4、最终微粒体:向步骤3的沉淀中加试剂二0.5 mL，盖紧后充分震荡溶解，4C保存待测。

NADPH-细胞色素C还原酶测定操作:

1.分光光度计/酶标仪预热30 min，调节波长到550 nm,蒸馏水调零。

2.试剂二在37°C水浴中预热30min。

3.空白管:取微量石英比色M/96孔板，依次加入10uL蒸馏水、180uL 试剂二、10uL 试剂三和10μL试剂四，迅速混匀后于550nm处测定2min内吸光值变化，第10s和第130s吸光值。OA空白管=A2-A1。

4.测定管:取微量石英比色皿/96孔板，依次加入10uL提取液、180uL 试剂二、10uL 试剂三和10μL试剂四，迅速混匀后于550nm处测定2min内吸光值变化，第10s 和第130s吸光值。△A测定管=A4-A3。

注意:空白管只需做- -次。

NCR活性计算公式公式:

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

(1)按蛋白浓度计算

活性单位定义: 37"C中， 每毫克蛋白每分钟催化产生1umol还原型细胞色素C为1个酶活单位。

NCR (nmol/min /mg prot)= (OA测定管-OA空白管)+(εxd)xV反总+ (CprxV样) +T= 550x(OA测定管-OA空白管)+Cpr

(2)按样本质量计算

活性单位定义: 37"C中， 每克组织每分钟催化产生1μmol 还原型细胞色素C为1个酶活单位。

NCR (nmol/min/g鲜重)= (OA测定管-OA空白管)+(εxd)xV反总+(V样+V样总xW)+T=275<(OA测定管-△A空白管)+Wε:还原型细胞色素C摩尔消光系数, 19100L/mol/cm=0.0191L/pumolcm; d:比色M皿光径(cm),lcm; V反总:反应体系总体积(L), 210uL=2.1x10*L; Cpr: .上清液蛋白质浓度(mg/mL)，

注意事项:

试剂三、试剂四临用前配制，配好未使用完的4C可保存两天。