辅酶ⅡNADP(H)含量测试盒

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义

辅酶ⅡNADP(H)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，NADP+和 NADPH 含量测定可以计算 NADP（NADPH + NADP+)含量和 NADPH/NADP+比值，其变化与磷酸戊糖途径和生物合成以及抗氧化反应密切相关。NADPH/NADP+比值不仅是细胞氧化还原态的主要标志之一，而且在 PPP 途径、生物合成和抗氧化代谢中具有重要调控作用。

测定原理

分别用酸性和碱性提取液提取样品中 NADP+和 NADPH。NADPH 通过 PMS 的递氢作用，使氧化型噻唑蓝（MTT）还原为甲瓒，570nm 下检测吸光值，从而测定 NADPH 含量。利用 6-磷酸葡萄糖脱氢酶还原 NADP+为 NADPH，从而检测 NADP+含量。

所需的仪器和用品

可见分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1 mL 玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制

酸性提取液：50mL×1 瓶，4℃保存；

碱性提取液：50mL×1 瓶，4℃保存；

试剂一：液体 15 mL×1 瓶，4℃保存；

试剂二：粉剂×1 支，-20 ℃保存，用时加入 4mL 蒸馏水，混匀；用不完的试剂 4℃保存一周；

试剂三：粉剂×1 支，-20℃保存，用时加入 4mL 蒸馏水，混匀；用不完的试剂 4℃保存一周；

试剂四：粉剂×1 支，4 ℃保存，用时加入 4mL 蒸馏水，混匀；用不完的试剂 4℃保存一周；

试剂五：液体 1.8mL×1 支，4 ℃保存；

试剂六：液体 30mL×1 瓶，4 ℃保存；

试剂七：液体 50mL×1 瓶，4 ℃保存。

NADP+和 NADPH 的提取1 血清（浆）中 NADP+和 NADPH 的提取NADP+的提取：按照血清（浆）体积（mL）：酸性提取液体积（mL）为 1：5~10 的比例（建议取约 0.1mL 血清（浆），加入 1mL 酸性提取液），95℃水浴 5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 碱性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

NADPH 的提取：按照血清（浆）体积（mL）：碱性提取液体积（mL）为 1：5~10 的比例（建议取约 0.1mL 血清（浆），加入 1mL 碱性提取液），95℃水浴 5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 酸性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

2 组织中 NADP

+和 NADPH 的提取：NADP+的提取：按照组织质量（g）：酸性提取液体积（mL）为 1：5~10 的比例（建议取约 0.1g组织，加入 1mL 酸性提取液），冰浴研磨，95℃水浴 5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 碱性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

NADPH 的提取：按照组织质量（g）：碱性提取液体积（mL）为 1：5~10 的比例（建议取约0.1g 组织，加入 1mL 碱性提取液），冰浴研磨，95℃水浴 5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 酸性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

3 细胞或细菌中 NADP

+和 NADPH 的提取：NADP+的提取：先收集细胞或细菌到离心管内，弃上清，按照细菌或细胞数量（104 个）：酸性提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 酸性提取液），超声波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次），95℃水浴 5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 碱性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

NADPH 的提取：先收集细胞或细菌到离心管内，弃上清，按照细菌或细胞数量（104 个）：碱性提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 碱性提取液），超声波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次），95℃水浴 5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 酸性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

测定步骤

1、 分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 570nm，蒸馏水调零。

2、 加样表(在 1.5mL 棕色 EP 管中按下表依次加样）：

                 充分混匀，静置 5min 后，20000g，25℃离心 5min，弃上清，沉淀中加入：

                 混匀，570nm 下比色，读取对照吸光值 A1 和测定管吸光值 A2，计算△A=A2-A1。

注意事项

1、如果一次性测定样本数较多，可将试剂一、二、三和四按比例配成混合液。

2、对照管和测定管的测定步骤的区别：对照管加完试剂一、二、三、四和五后必须马上加试剂六；测定管加完试剂一、二、三、四和五后必须反应 20min 后再加试剂六。

3、反应过程中注意避光。

4、若 NADP+测定中△A（A2-A1）≤0.0144，NADPH 测定中△A（A2-A1）≤0.0259，说明样本中辅酶含量较低，已低于检测限，可做如下调整：（1）将测定管避光静置时间 20min延长到 60min；（2）在提取阶段增加取样量，即取 0.2g 样本或 0.2mL 样本加入 1mL 提取液。

5、由于每一个测定管需要设一个对照管，本试剂盒 50 管保证测 24 个 NADP+或 NADPH。

NADP+和 NADPH 含量的计算

（一）NADP+含量的计算

标准条件下的回归曲线为 y = 0.197x + 0.0144，R2 = 0.9998；其中 y 为△A，x 为 NADP+浓度 nmol/mL

1、血清（浆）中 NADP+含量计算

NADP+含量(nmol/mL）=[ (△A -0.0144）÷0.197×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 101.5×(△A -0.0144）

2、组织、细菌或细胞中 NADP+含量计算

(1)按样本蛋白浓度计算

NADP+(nmol/mg prot）=[(△A -0.0144）÷0.197×V1) ]÷(V1×Cpr)= 5.1×(△A -0.0144）÷Cpr

(2)按样本鲜重计算

NADP+(nmol/g 鲜重）= [(△A -0.0144）÷0.197×V1)] ÷(W×V1÷V2)=10.2×(△A -0.0144）÷W

(3)按细菌或细胞密度计算

NADP+(nmol/104 cell）=[(△A -0.0144）÷0.197×V1)] ÷(500×V1÷V2)=0.02×(△A -0.0144）

（二）NADPH 含量的计算

标准条件下的回归曲线为 y = 1.2396x + 0.0259，R2 = 0.9977；其中 y 为△A，x 为 NADPH浓度 nmol/mL

1、血清（浆）中 NADPH 含量计算

NADPH 含量(nmol/mL）= [(△A -0.0259）÷1.2396×V1)] ÷(V3×V1÷V2)= 16.1× (△A -0.0259）

2、组织、细菌或细胞中 NADPH 含量计算

(1)按样本蛋白浓度计算

NADPH (nmol/mg prot）=[ (△A -0.0259）÷1.2396×V1)] ÷(V1×Cpr)= 0.8× (△A -0.0259）÷Cpr

(2)按样本鲜重计算

NADPH (nmol/g 鲜重）=[(△A -0.0259）÷1.2396×V1) ]÷(W×V1÷V2)=1.6× (△A -0.0259）÷W

(3)按细菌或细胞密度计算

NADPH (nmol/104 cell）=[(△A -0.0259）÷1.2396×V1) ]÷(500×V1÷V2)=0.003× (△A -0.0259）

V1：加入反应体系中样本体积，0.05mL；V2：加入提取液体积，2mL；V3：加入血清（浆）体积：0.1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500 万。

注意：最低检测限为 0.01nmol/mL 或 0.01nmol/g 鲜重 或 0.001nmol/mg prot