碱性木聚糖酶测试盒

注意：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

测定意义

木聚糖酶(EC 3.2.1.8)主要由微生物产生，能催化水解木聚糖，也被称为戊聚糖酶或半纤维素酶，可分解酿造或饲料工业中的原料细胞壁以及 β-葡聚糖，降低酿造中物料的粘度，促进有效物质的释放，以及降低饲料中的非淀粉多糖，促进营养物质的吸收利用，因而广泛的应用于酿造和饲料工业中，BAX 一般分离自最适生长 pH 为 9 -11 的微生物。

测定原理

BAX 在碱性环境中催化木聚糖降解成还原性寡糖和单糖，在沸水浴条件下进一步与 3,5-二硝基水杨酸发生显色反应，在 540nm 处有特征吸收峰，反应液颜色的深浅与酶解产生的还原糖量成正比，通过测定反应液在 540nm 吸光值增加速率，可计算 BAX 活力。

自备实验用品及仪器

天平、低温离心机、恒温水浴锅，可见分光光度计、1 mL 玻璃比色皿和蒸馏水。

试剂组成和配制

缓冲液：液体 65mL×1 瓶，4℃保存。

试剂一：液体 10mL×1 瓶，4℃避光保存。（若出现白色絮状或颗粒状沉淀，可 60℃加热溶解后使用）。

试剂二：液体 15mL×1 瓶，4℃避光保存。

粗酶提取

1. 发酵液：发酵液于 8000g，4℃，离心 15min，取上清，作为待测样品。

2. 酶干粉：称约 0.1mg，加 1mL 缓冲液溶解待测。

3. 组织样本：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g组织，加入 1mL 缓冲液）进行冰浴匀浆，然后 8000g，4℃，离心 10min，取上清待测。

测定操作表

BAX 计算公式

标准曲线：y = 2.8432x - 0.0293，R2= 0.9985

1. 按液体体积活力计算：

酶活定义：50℃，pH9.0 条件下，每毫升液体样本每分钟分解木聚糖产生 1nmol 还原糖所需的酶量为一个碱性木聚糖酶的活力单位。

BAX 活力（nmol/min/mL）= （ΔA+0.0293）÷2.8432÷150÷T×稀释倍数×106= 391× (ΔA+0.0293)

2. 按蛋白浓度计算：

酶活定义：50℃，pH9.0 条件下，每毫克蛋白每分钟分解木聚糖产生 1nmol 还原糖所需的酶量为一个碱性木聚糖酶的活力单位。

BAX 活力（nmol/min/mg prot）= （ΔA +0.0293）÷2.8432÷150÷T×稀释倍数×106÷Cpr= 391×(ΔA +0.0293 ) ÷Cpr

3. 按鲜重计算：

酶活定义：50℃，pH9.0 条件下，每克样本每分钟分解木聚糖产生 1nmol 还原糖所需的酶量为一个碱性木聚糖酶的活力单位。

BAX 活力（nmol/min/g 鲜重）= （ΔA +0.0293）÷2.8432÷150÷T×稀释倍数×106÷W= 391×(ΔA +0.0293 ) ÷W150：木糖的分子量；T：反应时间，30min；稀释倍数=V 反总÷V 样=1000µL÷200µL=5；106：转化因子，即 1mg/mL=106ng/mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g。

注意事项

1. 吸光度变化应该控制在 0.01~0.8 之间，否则加大样品量或稀释样品，注意计算公式中参与计算的稀释倍数要相应改变；也可以延长或者缩短反应时间。

2. 试剂盒 2-8℃保存，保质期 3 个月，建议尽快使用。