蔗糖磷酸化酶(SP)测试盒

注意:正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义

SP(EC2.4.1.7)主要存在于微生物和植物中，裂解葡萄糖苷键，催化葡萄糖基转移到果糖、木糖、半乳糖和鼠李糖等，合成相应的葡萄糖基低聚糖。此外，SP还能催化氢醌合成熊果苷,具有极强的美白效果，在化妆品工业中具有重要应用。

测定原理

SP能够以磷酸为受体，催化蔗糖产生1-磷酸葡萄糖，在葡萄糖磷酸变位酶催化下变位为6-磷酸葡萄糖，在6-磷酸葡萄糖脱氢酶作用下还原NADP生成NADPH，导致340nm光吸收值增加。测定340nm吸光度增加速率，即可计算SP活性。

自备实验用品及仪器

天平、低温离心机、恒温水浴锅、紫外分光光度计、1 mL石英比色皿和蒸馏水。

试剂组成和配制

提取液:液体50mLx1瓶，4'C保存。

缓冲液:液体40mLx1瓶，4'C保存。

试剂一:液体25mLx1瓶，4'C保存。

试剂二:液体2mLx1支，4C保存。

试剂三:液体lmLx1支，4C保存。

试剂四:粉剂1瓶，-20C避光保存，临用前加5mL双蒸水溶解。

试剂五:粉剂1瓶，-20°C避光保存，临用前加5mL双蒸水溶解。

试剂六:粉剂1瓶，-20°C避光保存， 临用前加10mL双蒸水溶解。

试剂七:粉剂1瓶，-20"C避光保存，临用前加10mL双蒸水溶解。

粗酶液提取

1. 组织:按照组织质量(g): 提取液体积(mL)为1: 5~10的比例(建议称取约0.1g组织，加入lmL提取液)进行冰浴匀浆，然后10000g, 4C，离心10min,取上清待测。

2. 细菌、真菌:按照细胞数量(10*个): 提取液体积(mL)为500~1000: 1的比例(建议500万细胞加入lmL提取液)，冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3秒，间隔7

秒，总时间3min);然后1000g，4C，离心10min，取上清置于冰上待测。

测定操作表

SP活性计算公式

1.按照蛋白浓度计算

酶活定义: 37C, pH6.8时，每毫克蛋白质每分钟催化产生lnmol NADPH为一个酶活单位。

SP活性(nmol/min/mg prot) =, xV反总+V样:Cpr-T-804x△A+Cprεxd

2.按照样本质 量计算

酶活定义: 37C，pH6.8时，每克样本每分钟催化产生lnmol NADPH为一个酶活单位。

MASP活性( nmol/min/g 鲜重) =xV反总+:(V样+V样总xW)+T=804x△A+Wεxd

3.按照细胞数量计算

酶活定义: 37°C， pH6.8时，每10*个细胞每分钟催化产生lnmol NADPH为一个酶活单位。

SP活性(nmol/min/10+ cell) =,xV反总+(V样+V样总x细胞数量(万个) )+T=804x△εxdA+细胞数量(万个)ε: NADPH摩尔消光系数，6220 L/mol/cm; d:比色皿光径，1cm; V反总:反应体系总体积，2mL; V样:反应体系中样本体积，0.2mL; W:样本质量，g; Cpr:蛋白浓度, mg/mL;T:反应时间，2min

注意事项

1.粉剂-20°C 保存，配制好的试剂3天内使用完。

2.可选用BCA法测定蛋白含量试剂盒测定蛋白含量。