FDA/PI双染细胞活力检测试剂盒

产品简介：

FDA/PI 双染细胞毒性检测试剂盒是利用细胞荧光染料 FDA 和 PI 对细胞进行染色，利用 FDA 标记靶细胞，PI 标记死的靶细胞来区分不同的细胞，活的靶细胞成绿色，死的靶细胞成红色（和绿色），从而检测细胞毒性作用。

 根据不同的实验方案设计，可以用来检测细胞活性/化合物的细胞毒性作用。也可以用来检测杀伤性 T 细胞或 NK 细胞介导的细胞毒作用。

 FDA 是一种可对活细胞进行荧光标记的染料，可以标记活体细胞。FDA 是一种非荧光疏水性荧光素衍生物，它可以通过细胞膜。FDA 在结构上将酚羟基部位改造成 AM 体，所以自身不发荧光，荧光背景低，脂溶性高，能够轻易穿透细胞膜，进入细胞内的 FDA 的 AM部位能被细胞内酯酶水解高荧光产物荧光素的二乙酸酯基团。通过共价结合赖氨酸侧链的氨基而掺入细胞内的蛋白，且结合后发出强的绿色荧光。荧光素分子在具有完整膜的细胞中积累，因此绿色荧光可用作细胞活力的标记。不具有活性代谢的细胞可能不会积聚荧光产物，因此不会显示出绿色荧光。

 FDA 毒性小，不影响细胞的增殖能力。此方法操作简单，且不用放射性同位素，不存在安全隐患。可以更快速，更准确和更安全地得到想要的实验数据。

 FDA/PI 标记细胞后通常用流式细胞仪进行细胞毒性检测。

 FDA 标记细胞呈绿色荧光，荧光波长：λex=496 nm, λem=516 nm。流式检测时的激发波长可以选择 488nm，此时的发射波长为 516nm，使用流式细胞仪检测时可以采用 FL1 detectionchannel。PI 标记细胞呈红色荧光，流式检测时的激发波长可以选择 488nm，此时的发射波长为 647nm，使用流式细胞仪检测时可以采用 FL2 detection channel。

 FDA 标记的细胞除了流式细胞仪检测细胞毒性外，还可单染后用于细胞增殖检测，或者用荧光酶标板定量活细胞数目，或者用荧光显微镜进行均一染色的细胞示踪观察。

 FDA 的荧光产物的细胞内保留特性较差，一般 2 小时保留率低于 20%，需要保留特性较好的细胞质染料的可以选择其它货号的产品，例如 Calcein AM 染料。

产品应用：

1.流式细胞仪

2.激光共聚焦

3.荧光显微镜

使用方法：

1.旋帽离心管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。

2.染色浓度根据细胞种类的不同和每孔内细胞数量的多少而异。

3.FDA 母液极易水解，建议分装保存，分装后用封口膜密封管口，再用锡箔纸包裹，最后和干燥剂一起用塑料袋密封，≦-20℃冷冻保存。

4.冬天气温较低时 FDA 溶解液会凝固，可先在 37℃水浴至溶解液完全融解后再进行配制，配制过程中注意避免溶液凝固，保持温度至 FDA 溶解完全。

5.FDA 工作液应现配现用，不能提前配制，因为 FDA 吸水会分解，影响染色效果。

6.FDA 易被水解，在水溶液中会很快变质。母液请在使用过程中避免接触水。工作液在标记细胞的过程中和水接触是在许可的时间范围内的。

7.FDA 标记细胞仅需 5-15 分钟即可完成。对于不同细胞，最佳标记时间需自行摸索。正式实验前，建议先做几个孔摸索染色浓度和加入 FDA 试剂后的培养时间。

8.荧光染料均存在淬灭问题，请尽量注意避光，以减缓荧光淬灭。

9.以下实验步骤仅供参考，请根据实际的实验方案设计或参考相关文献为准。

10.必须设置全阴，FDA 单标，PI 单标的靶细胞的参照以设置流式。

11.可以使用以下方法来优化得到两种荧光染料的最佳工作浓度。1) 用 0.1%皂素或者 0.1-0.5%地高辛孵育细胞 10min，或者用 70%乙醇孵育细胞 30min，从而制备死细胞；2) 用 50 倍-100 倍稀释（试剂盒中的母液）的PI 溶液进行死细胞染色，以得到仅仅对细胞核染色，而不会对细胞质染色的最佳工作浓度。3) 用 5000 倍-500倍稀释（试剂盒中的母液）的 FDA 进行死细胞染色，以得到不会对细胞质染色的最佳工作浓度。然后用此浓度进行活细胞染色，去观察是否活细胞能被染色。

细胞模型制备：

1. 收集待检测的靶细胞。

2. 进行相应的毒性药物处理或者效应细胞处理。

细胞 FDA 染色：

1. 根据需要检测的细胞样品数，用 HBSS 将 FDA 母液 500-4000 倍稀释，配制成 FDA 染色工作液。不同的细胞需要根据预实验结果确定最佳染色浓度。如果荧光强度弱，可以适当提高 FDA 的终浓度。如果背景太高，可以适当降低 FDA 的终浓度，请摸索条件找到最佳浓度。

2. 将培养好的待测靶细胞消化后收集，用 PBS 洗涤 2 次。

3. 将待测细胞用染色工作液重悬，至细胞浓度大约 107/ml。

4. 在 37℃培养箱中避光孵育 15-30 分钟。

5. 孵育结束，500 g 离心 5 分钟。

6. 移除上清液，再次缓慢加入 37℃预热的培养基或 HBSS 重悬细胞。

7. 重复（5），（6）步骤两次。

细胞检测：

1. 收集 FDA 孵育好的 HBSS 重悬细胞。

2. 在 500ul 细胞悬液中加入 10ul PI 染色液，混匀。

3. 在 2-8℃避光孵育 2-10 分钟。

4. 在 400g 离心 5 分钟收集细胞。

5. 用 500ul HBSS 或 PBS 重悬细胞。

6. 取 500ul 细胞悬液，用流式细胞仪或荧光显微镜检测。

7. 根据流式结果计算死亡细胞百分率。被杀伤死亡的靶细胞被 PI 染上会出现在 FDA+PI+区域，未杀伤的在FDA+PI-区域，得出被杀伤的靶细胞的比例。用这个比例再计算毒性。

常见问题分析：

1.所有细胞都染上红色？

PI 浓度过高会导致活细胞也被染色，需要优化 PI 的使用浓度，稀释至仅对死细胞核染色，而不会对细胞质染色的最佳工作浓度。

2.细胞被同时染上绿色和红色？

样本中有大量晚期凋亡细胞时，细胞胞浆会有 FDA 着色并呈碎片状，而且 PI 也为阳性。

注意事项：该产品仅供科研实验使用，未经允许不得用于其它用途！以实际收货产品说明书为准，网站说明书仅供参考。