线粒体耗氧率检测试剂盒

产品简介：

线粒体氧气消耗检测试剂盒（Mitochondrial Oxygen Consumption RateAssay Kit）是利用合成的特异性氧气荧光探针 R02 来检测分离线粒体耗氧情况变化的试剂盒。可以通过简单的混合基于荧光酶标仪便捷的直接进行耗氧量测定。

 耗氧量分析是研究代谢的有用工具。耗氧量测量结果是细胞代谢功能，更具体而言是线粒体功能的关键性指示。通过这类指标来探究活细胞代谢，可为细胞功能以及代谢变化在疾病进展中的作用提供深入洞察。

 线粒体功能对细胞代谢、存活和能量产生至关重要。线粒体呼吸受损与病理状态（如癌症、缺血性再灌注损伤和神经退行性疾病）有关。线粒体毒性也是安全相关的抗药性和药物戒断症状的常见原因。

 R02 耗氧量分析可以实时测量分离线粒体的耗氧量，是以高通量形式来评估用于代谢表征的细胞线粒体呼吸以及评估治疗对线粒体功能毒性作用的一种可靠方法。它可以使用荧光酶标仪在标准微孔板上进行有氧代谢的简单动力学测定。随着呼吸作用的进行，溶解氧被消耗，样品中的氧气浓度降低，导致 R02 分析的信号增加，从而实现对耗氧量的测定。

 R02 是氧气敏感的荧光探针，最大激发波长为 468nm，最大发射波长为603nm。其荧光通过分子碰撞与氧气反应，由 O2 淬灭，在无氧条件下荧光强度更高，反之有氧条件下荧光强度变低，因此荧光信号的量与样品中线粒体外 O2 的量成反比，从而R02 可被用于监测线粒体氧气消耗的变化。在测定中，耗氧率由荧光信号随时间的变化计算。线粒体耗氧量增加，荧光信号的变化率增加；反之，耗氧量减少，荧光信号的变化率降低。

 R02 与 O2 的这种反应是非破坏性且完全可逆的，R02 对线粒体没有毒性，其是化学稳定的，惰性的，水溶性的和不渗透的，不能透过完整的线粒体膜。因此还可以同时与糖酵解， 线粒体膜电位 JC-1， ROS 和 ATP 等检测的试剂结合使用，进行多参数检测。

 用 R02 进行线粒体耗氧检测方法及其简单，不需要适用特殊的仪器设备，只需要荧光酶标仪之类的荧光读板设备即可。

 R02 采用可见光激发检测，相对于采用紫外光激发的检测试剂，损伤更低，对线粒体的毒害更小。结果更加准确客观。

 线粒体氧气消耗检测试剂盒可以用于直接，实时分析线粒体呼吸和线粒体功能。本试剂盒可以用来测量各种分离的线粒体，分离的酶，细菌，酵母和霉菌等的胞外耗氧情况测量。

 以 96 孔细胞培养板计，本试剂盒小包装可以检测 200 个样本。

 可以提供细胞凋亡、增殖、毒性、活性氧、细胞代谢、氧化应激、细胞膜流动性、膜通透性转换孔、细胞耗氧率、细胞内 pH、细胞粘附、细胞自噬等数百种检测试剂盒产品。

 可以为您提供各种颜色的M 系列、N 系列、L 系列、E系列、G 系列等细胞膜、细胞质、细胞核、溶酶体、线粒体、内质网、高尔基体、骨架、微管等细胞、细胞亚结构荧光染色试剂盒产品，以及钙离子、钠离子、氩离子等各种荧光染色试剂盒产品。

 可以提供动物、植物、微生物、酵母、水产、家禽、兽类、土壤等样本的各种生化指标检测的数百种试剂盒产品。

产品应用：

线粒体功能和细胞代谢研究

产品特点：

1.广泛适用于各种体外模型；不再局限于单层细胞，还能测定悬浮细胞、微生物和特定的 3D培养物；

2.简单的“混合-检测”方案允许使用多种其他分析试剂盒进行多参数分析；

3.可逆转，能够观察耗氧量的瞬态和长时间变化；

4.可适配多数荧光酶标仪以及标准 96 孔和 384 孔；

5.以高通量的形式方便地测量；

6.无需等待专用设备空闲所需的实验室时间，也无需大额资金专用设备投入。

使用方法：

1.螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体洒落。

2.细胞处理需要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。

3.并非所有细胞类型都消耗足够用于检测的氧气。

4.必须使用荧光培养专用的透明底黑色培养板，减少检测时各孔之间的光互相干扰。

关于仪器设置：

温度对检测有较大影响。有条件的话，务必使用配有温度控制的酶标仪。

常规的荧光信号强度测量，使用基于单色仪或基于过滤器的酶标仪，最佳激发波长使用 450-460nm，发射波长使用 586-600nm。可根据实际机器和样本选择信号最强的波长。

具有检测增益参数（PMT，Parameters）的通常设置为中或高。

TR-F 测量可减少非特异性背景和增加探针灵敏度。 最佳 delay time 为约 30μs，gate (integration)time 是100μs。

一般使用底部读数 bottom read。

关于氧气封闭液使用：

氧气封闭液可以用移液器吸取添加，添加时需要沿着培养板壁慢慢加入，使其顺板壁向下流到培养基表面。

也可以直接用滴瓶滴加，倒转预热的滴管瓶并轻轻施加压力，使封闭液足以充注瓶尖。 每个孔滴两滴，使每个液滴在孔侧面顺应向下流到培养基表面。

使用移液器添加封闭液时，可将黄色吸头的嘴部用锋利的刀片或剪刀修剪处理。将竖直吸头离尖端 3-4mm处 45°角修剪处理。

 取下滴管瓶内嘴盖，轻轻吸取预热的氧气封闭液。避免上下吹吸形成气泡。

关于线粒体接种密度：

注意所需的线粒体接种密度取决于细胞类型和获得线粒体的方法。 我们推荐进行线粒体接种密度预实验以确定最佳密度。通常从高线粒体密度（通常为 80,000 个细胞的线粒体，线粒体提取得率＞80%）开始，每孔的最佳线粒体数一般为：每孔提取 80,000 个细胞的线粒体（96 孔板）。

检测待测样品都设置 3 复孔。

注意始终在每个 96 孔板上留出至少 6 个孔，以免添加线粒体作为空白对照和信号控制孔。

关于对照孔设置：

一般空白孔要设置，其它对照根据实验需要决定。

（推荐对照设置，以下可选，非必须）：

操作步骤：

1. 准备线粒体模型。

2. 提取待检测线粒体，用 PBS 洗涤线粒体。

3. 加入 100ul 线粒体 HBSS 悬液。

4. 加入 10ul R02 氧荧光探针，充分混匀。

5. （选做）可以在此处添加待测试化合物（通常为 1-10μL）（如果需要的话）。

6. 每孔加入 100ul 氧气封闭液。

7. 然后用该 96 孔板进行荧光线粒体外 O2 消耗变化情况检测。

激发波长 468nm，发射波长 603nm。每 2 分钟或 3 分钟读取一次。

8. 绘制耗氧率曲线。

9. 计算每个样品的斜率值

常见问题分析：

1.耗氧率检测趋势跟预期的不一致？

检查线粒体接种和移液的一致性。

增加线粒体密度。

将测定体积减少到 60 微升。

在某些较短的检测时间区间内，会出现荧光数据的波动情况，出现斜率下降或不变化，需要扩大到更长的时间范围内来分析耗氧率趋势。一般检测时间范围不少于 30 分钟。

温度对检测有较大影响。有条件的话，务必使用配有温度控制的酶标仪，仪器以及所有培养基和储备溶液均须使用前 37℃预热。注意某些读板器的温度控制不一致，如果存在这种情况，请考虑将测定和平衡温度降低到 30℃，避开外圈。

2.使用的线粒体类型灵敏度不够？

可以考虑以下改善方案：

增加酶标仪的增益（PMT）设置。

在无酚红或无血清的情况下测定。

增加 R02 氧荧光探针的体积（15μL/孔）。

增加线粒体密度。

将测定体积减少到 60 微升。

测量底部读数（如果有）。

调整 TR-F 焦距。

注意事项：该产品仅供科研实验使用，未经允许不得用于其它用途！以实际收货产品说明书为准，网站说明书仅供参考。