细胞耗氧率检测试剂盒(R01荧光探针法）

产品简介：

细胞氧气消耗检测试剂盒（Oxygen Consumption Assay Kit / OxygenConsumption Rate Assay Kit / OCR Assay Kit）是利用合成的特异性氧气荧光探针R01 来检测细胞外耗氧情况变化的试剂盒。可以通过简单的混合基于荧光酶标仪便捷的直接进行耗氧量测定。

 耗氧量分析是研究代谢的有用工具。耗氧量测量结果是细胞代谢功能，更具体而言是线粒体功能的关键性指示。通过这类指标来探究活细胞代谢，可为细胞功能以及代谢变化在疾病进展中的作用提供深入洞察。

线粒体功能对细胞代谢、存活和能量产生至关重要。线粒体呼吸受损与病理状态（如癌症、缺血性再灌注损伤和神经退行性疾病）有关。线粒体毒性也是安全相关的抗药性和药物戒断症状的常见原因。

 R01 耗氧量分析可以实时测量全细胞或分离线粒体的耗氧量，是以高通量形式来评估用于代谢表征的细胞呼吸以及评估治疗对线粒体功能毒性作用的一种可靠方法。

它可以使用荧光酶标仪在标准微孔板上进行有氧代谢的简单动力学测定。随着呼吸作用的进行，溶解氧被消耗，样品中的氧气浓度降低，导致 R01 分析的信号增加，从而实现对耗氧量的测定。

产品应用：

线粒体功能和细胞代谢研究

产品特点：

1.广泛适用于各种体外模型；不再局限于单层细胞，还能测定悬浮细胞、微生物和特定的 3D培养物；

2.简单的“混合-检测”方案允许使用多种其他分析试剂盒进行多参数分析；

3.可逆转，能够观察耗氧量的瞬态和长时间变化；

4.可适配多数荧光酶标仪以及标准 96 孔和 384 孔；

5.以高通量的形式方便地测量；

6.无需等待专用设备空闲所需的实验室时间，也无需大额资金专用设备投入。

使用方法：

1.螺旋盖微量试剂管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体洒落。

2.细胞处理需要小心操作,尽量避免人为的损伤细胞。

3.以下操作以 96 孔细胞培养板为例。其他培养容器或装置请根据实际情况调整试剂用量和检测方法。各试剂等比例调整即可。O2 荧光探针终浓度 25 倍稀释最佳。

4.R01 探针的信号变化直接取决于所测量细胞类型的细胞呼吸速率，建议尽可能使用每孔高的细胞密度作为起点，并根据需要减少细胞数量。 

5.并非所有细胞类型都消耗足够用于检测的氧气。

6.必须使用荧光培养专用的透明底黑色培养板，减少检测时各孔之间的光互相干扰。

7.用于测定的所有仪器试剂溶液耗材均需 37℃预热。

8.添加氧气封闭液时注意避免产生气泡。

9.尽可能使用多通道移液器添加试剂。

10.如果药物有红色荧光（如阿霉素等）需要换液，不含培养基和待测药物，用 HBSS 或 PBS 体系检测，在无血清无酚红环境检测。

11.建议设定 FCCP 处理的阳性对照样本。

关于仪器设置：

温度对检测有较大影响。有条件的话，务必使用配有温度控制的酶标仪。

常规的荧光信号强度测量，使用基于单色仪或基于过滤器的酶标仪，最佳激发波长使用 450-460 nm，发射波长使用 586-600 nm。可根据实际机器和样本选择信号最强的波长。

具有检测增益参数（PMT，Parameters）的通常设置为中或高。

使用 bottom read 读数和 top read 读数均可，基于不同的细胞模型，建议在预实验时两种读数模式均尝试

下，看哪种的趋势更加明显。

关于氧气封闭液使用：

氧气封闭液可以用移液器吸取添加，添加时需要沿着培养板壁慢慢加入，使其顺板壁向下流到培养基表面。

也可以直接用滴瓶滴加，倒转预热的滴管瓶并轻轻施加压力，使封闭液足以充注瓶尖。 每个孔滴两滴，使每个液滴在孔侧面顺应向下流到培养基表面。

使用移液器添加封闭液时，可将黄色吸头的嘴部用锋利的刀片或剪刀修剪处理。将竖直吸头离尖端 3-4 mm处 45°角修剪处理。

取下滴管瓶内嘴盖，轻轻吸取预热的氧气封闭液。避免上下吹吸形成气泡。

关于细胞培养：

对于贴壁细胞，在 200 μL 培养基中的 96 孔板中接种细胞。在 37°C 的 CO2 培养箱中孵育过夜。

对于悬浮细胞，在检测当天在 100 μL 培养基中接种。

注意所需的接种密度取决于细胞类型。 我们推荐进行细胞接种密度预实验以确定最佳密度。通常从高细胞

密度（通常为 60,000）开始，每孔的最佳细胞数一般为：贴壁细胞每孔 80,000 个细胞，悬浮细胞每孔 5-6 x 105（96 孔板）。

检测待测样品都设置 3 复孔。

注意始终在每个 96 孔板上留出至少 6 个孔，以免添加细胞作为空白对照和信号控制孔。

1. 准备

细胞模型。

2. 培养好的待检测细胞移除培养基，用 PBS 洗涤细胞。

3. 加入 100 μL 新鲜培养基。

4. 加入 4 μL R01 氧荧光探针，充分混匀。

5. （可选）可以在此处添加待测试化合物（通常为 1-10μL）（如果需要的话）。

6. 每孔加入 100 μL 氧气封闭液。

7. 然后用该细胞板进行荧光细胞外 O2 消耗变化情况检测。

激发波长 455 nm - 468 nm，发射波长 603 nm。测定荧光强度，每 2 分钟或 3 分钟读取一次。

8. 绘制耗氧率曲线。

9. 计算每个样品的斜率值。

常见问题分析：

1.耗氧率检测趋势跟预期的不一致？

可以从以下方面改善：

检查细胞接种和移液的一致性。

增加细胞密度。

将测定体积减少到 60 微升。

在某些较短的检测时间区间内，会出现荧光数据的波动情况，出现斜率下降或不变化，需要扩大到更长的时间范围内来分析耗氧率趋势。一般检测时间范围不少于 30 分钟。

温度对检测有较大影响。有条件的话，务必使用配有温度控制的酶标仪，仪器以及所有培养基和储备溶液均须使用前 37℃预热。注意某些读板器的温度控制不一致，如果存在这种情况，请考虑将测定和平衡温度降低到 30℃，避开外圈。

2.使用的细胞类型灵敏度不够？

可以考虑以下改善方案：

增加酶标仪的增益（PMT）设置。

在无酚红或无血清的情况下测定。

增加 R01 氧荧光探针的体积（至 10 μL/孔）。

减少 R01 氧荧光探针的体积（至 2 μL/孔）。

增加细胞密度。

将测定体积减少到 60 微升。

测量底部读数（如果有）。

调整焦距。

注意事项：该产品仅供科研实验使用，未经允许不得用于其它用途！以实际收货产品说明书为准，网站说明书仅供参考。