His标签蛋白纯化填料（带柱子） 

产品简介：

His 标签蛋白纯化填料支持物为 Ni‐IDA CL-6B 琼脂糖凝胶，载量为 20mg 6*His 标签蛋白/ml 填料。

 Ni‐IDA 亲和层析介质是把 IDA（亚氨基二乙酸）共价偶联到 4 %交联的琼脂糖介质上，再通过 IDA 的 3 个结合位点螯合 Ni2+制备而成，并提供了三个离子键结合部位高亲和地纯化含有多聚组氨酸标签的重组蛋白。Ni‐IDA 亲和层析介质的 Ni2+脱落程度很低，并具有高吸附量及高稳定性，在多聚组氨酸标签的重组蛋白的纯化实验中有非常好的表现力。该系统在天然或变性条件下，对来源于各种表达系统（如杆状病毒，哺乳细胞，酵母以及细菌）中的His 标签蛋白，均有很好的纯化效果。

 本产品已螯合镍离子，可直接用可溶性蛋白的纯化，使用方便，快捷。填料可重复使用。

 可以提供针对动物细胞、组织、植物、真菌、酵母、微生物、液体、土壤等不同样本的蛋白提取试剂盒，包含用于非双向电泳和双向电泳等不同下游应用的试剂盒以及含去垢剂成分和不含去污剂成分的蛋白提取试剂盒，专用于蛋白质谱检测的试剂盒等总计 300 多种蛋白提取试剂盒可供选择。还可以提供针对动物、植物等不同样 本的细胞核、线粒体、溶酶体、叶绿体等不同细胞器的提取试剂盒。

使用方法：

1.样品中不能含有 β-巯基乙醇、DTT 和 EDTA、EGTA 等。

2.整个纯化过程中切忌凝胶脱水变干。

3.为提高纯化效率，首先确定 Binding Buffer 和 Elution Buffer 中咪唑的最佳使用浓度。必要时可以使用线性或梯度浓度的咪唑浓度，Binding Buffer 的范围为 0-10 mM，洗脱缓冲液的范围为 10-500 mM 来进行。并通过SDS-PAGE 或 Western Blotting 来检测目的蛋白的纯度。

4.请使用高纯度的试剂配制缓冲液，并通过 0.22 μm 或者 0.45 μm 过滤器过滤。为避免柱子被堵塞，建议将裂解液进行离心，或者使用 0.22 μm 或者 0.45 μm 过滤器过滤。

5.柱再生时，保证每步洗完后都要用足够的去离子水冲洗至中性。

填料参数：

填料体积： 10 ml

动态吸附量： 20 mg 6×His 标签蛋白（27 kD）/ml 介质

球形基质： 4 %交联度琼脂糖

平均粒径： 90 μm （45‐165 μm）

储存溶剂： 1× PBS（含 20%乙醇）

天然条件下纯化多聚组氨酸标签蛋白

缓冲液配制

用于配制缓冲液的水和化学试剂必须是高纯度的，并建议使用前用 0.45 μm 滤膜过滤一遍。

平衡缓冲液：50 mM NaH2PO4，300 mM NaCl，用 NaOH 调 pH 为 8.0

洗涤缓冲液：50 mM NaH2PO4，300 mM NaCl，10 mM 咪唑，用 NaOH 调 pH 为 8.0

洗脱缓冲液：50 mM NaH2PO4，300 mM NaCl，250 mM 咪唑，用 NaOH 调 pH 为 8.0

组装层析柱

1． 将 Ni-Agarose Resin 填料混匀后加入层析柱，室温静置 10 分钟，待凝胶与溶液分层后，把底部的出液口打开，让乙醇通过重力作用缓慢流出。

2． 向装填好的柱中加入 5 倍柱体积的去离子水将乙醇冲洗干净后，再用 10 倍柱体积的 Binding Buffer 平衡柱子，平衡结束后即可上样。

可溶性蛋白的纯化

以下以可溶性蛋白纯化为例，使用时以实际样本为准。

1． 收集菌体后，每 100 mg 菌体（湿重）加入 1-5 ml 细菌裂解液（每 1 ml 细菌抽提试剂中已加入 10 μl 蛋白酶抑制剂混合物），超声裂解菌体。

2． 10000 rpm,4℃离心 3 分钟，收集上清中的可溶性蛋白。

3． 用 Binding Buffer 将菌体裂解液等倍稀释后负载上柱，流速为 10 倍柱体积/小时，收集流穿液。

4． 使用 15 倍柱体积的 Binding Buffer 冲洗柱子，洗去杂蛋白。

5． 使用适量 Elution Buffer 洗脱，收集洗脱峰。

6． 洗脱后，依次使用 10 倍柱体积的去离子水洗涤柱子，再用 3 倍柱体积的 20%乙醇平衡（乙醇要将填料浸没），封柱后 2-8℃保存。

柱再生

当填料使用多次后，结合效率会有所下降（表现为流速变慢或填料失去蓝绿色），可以用以下方法再生，提高填料的使用寿命和蛋白质的结合效率。

1． 使用 2 倍柱体积的 6 M 盐酸胍冲洗后，使用 3 倍柱体积的去离子水冲洗。

2． 使用 1 倍柱体积的 2% SDS 冲洗。

3． 依次使用 1 倍柱体积的 25%、50%、75%和 5 倍柱体积的 100%乙醇冲洗，再依次使用 1 倍柱体积的75%、50%和 25%的乙醇冲洗。

4． 使用 1 倍柱体积的去离子水冲洗。

5． 使用 5 倍柱体积含 50 mM EDTA 缓冲液（PH8.0）冲洗。

6． 使用 3 倍柱体积去离子水，3 倍柱体积 20%乙醇冲洗。

7． 置 2-8°C 保存。

8． 再次使用前，需首先使用 10 倍柱体积去离子水冲洗，然后使用 5 个柱体积的 50 mM NiSO4 再生，3 个柱体积的 Binding Buffer 平衡。

9． 为了长时间的保存，介质应当 2‐8 ℃保存在 1× PBS（含 20 % 乙醇）中。

常见问题分析：

His 标签蛋白纯化过程，经常出现的问题包括几个方面：

1、 纯化的组分中没有 His 标签的蛋白?

2、 HIS 标签蛋白洗脱后杂带较多? 

我们可以根据检测上柱前蛋白，流穿液蛋白，和洗脱液蛋白的检测，来进行基本的判断。是否包涵体蛋白？是否标签没有表达出来：可能是因为折叠构象不正确导致标签在重折叠时没有位于蛋白质分子的表面上无法与离子柱结合；或者标签在折叠时没有位于蛋白质分子的表面上；蛋白不溶解或沉淀在柱子上：要留意缓冲液体的 pH，此外在样品中添加一些表面活性剂甚至乙醇等有机溶剂可以增加疏水性蛋白的溶解度，对于带半胱氨酸多的蛋白很容易氧化聚集沉淀，所以需要加 2-5mM 巯基乙醇避免沉淀。

注意事项：该产品仅供科研实验使用，未经允许不得用于其它用途！以实际收货产品说明书为准，网站说明书仅供参考。