丙酮酸脱氢酶（PDH)测试盒

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义

PDH（EC 4.1.1.1）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是丙酮酸脱氢酶复合体(PDHC)催化丙酮酸氧化脱羧的限速酶，催化丙酮酸脱梭生成羟乙基-TPP，把糖酵解和三羧酸循环连接起来。

测定原理

PDH 催化丙酮酸脱氢，同时还原 WST-8 产生黄色物质，从而导致 450nm 光吸收的增加。

需自备的仪器和用品

可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL 玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制

试剂一：50mL×1 瓶，-20℃保存；

试剂二：10mL×1 瓶，-20℃保存；

试剂三：1mL×1 支，-20℃保存；

试剂四：液体 30mL×1 瓶，4℃保存；

试剂五：粉剂×1 瓶，-20℃保存，临用前加入 20mL 蒸馏水溶解待用，用不完的-20℃保存；

试剂六：液体 6mL×1 瓶，4℃避光保存；

样本的前处理

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：

1、 称取约 0.1g 组织或收集 500 万细菌或细胞，加入 1mL 试剂一和 10uL 试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

2、 将匀浆 600g，4℃离心 5min。

3、 弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心 10min。

4、 上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的 PDH（此步可选做）。

5、 在步骤④的沉淀中加入 200uL 试剂二和 2uL 试剂三，超声波破碎（冰浴，功率 20％或200W，超声 3 秒，间隔 10 秒，重复 30 次），用于线粒体 PDH 活性测定。

测定步骤

1、 分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 450nm 处，蒸馏水调零。

2、按照试剂四：试剂五：试剂六=500μL：300μL：100μL 的比例，依样本数量配制工作液，临用前配制。

3、在 1mL 玻璃比色皿中加入 100μL 样本和 900μL 工作液，混匀，立即记录 450nm 处初始吸光值 A1 和 2min 后的吸光值 A2，计算ΔA=A1-A2。

PDH 活性计算

标准曲线为 y = 13.5856x - 0.0009，R2 = 0.9991；其中 y 为 ΔA，x 为浓度 μmol/mL。

（1） 按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟还原 1 nmol WST-8 定义为一个酶活性单位。

PDH（nmol/min/mg prot）=(ΔA+0.0009)÷13.5856×V 反总÷(V 样×Cpr) ÷T×1000=368×ΔA÷Cpr

（2） 按样本鲜重计算

单位的定义：每 g 组织每分钟还原 1 nmol WST-8 定义为一个酶活性单位。

PDH（nmol/min/g 鲜重）=(ΔA+0.0009)÷6.7928×V 反总÷(W× V 样÷V 样总)÷T×1000=74.3×ΔA÷W

（3） 按细菌或细胞密度计算

单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟还原 1 nmol WST-8 定义为一个酶活性单位。

PDH（nmol/min /104 cell）=(ΔA+0.0009)÷6.7928×V 反总÷(500×V 样÷V 样总)÷T×1000=0.149×ΔAV 反总：反应体系总体积，1mL；V 样：加入样本体积，0.1 mL；V 样总：加入提取液体积，0.202 mL；T：反应时间，2 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万;1000，μmol 到 nmol 的转换系数。