丙酮酸（PA)含量测试盒

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

丙酮酸通过乙酰 CoA 连接葡萄糖、脂肪酸和氨基酸三大代谢，起着重要的枢纽作用。

测定原理：

丙酮酸与 2,4-二硝基苯肼作用，生成丙酮酸-2,4-二硝基苯腙，在碱性溶液中呈色。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1 mL 玻璃比色皿、研钵、冰、蒸馏水。

试剂的组成和配制：

提取液：液体 50mL×1 瓶，4℃保存；

试剂一：液体 5mL×1 瓶， 4℃保存；

试剂二：液体 25mL×1 瓶， 4℃保存。

丙酮酸提取：

1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液），超声波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次），静置 30min， 8000g，25℃离心 10min，取上清待测。

2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆，静置 30min，8000g，25℃离心 10min，取上清待测。

3、血清（浆）样品：按照血清（浆）体积（mL）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议取 0.1mL 血清（浆）加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆，静置 30min， 8000g，25℃离心 10min，取上清待测。

测定步骤：

1、 分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 520nm，蒸馏水调零。

2、取 300μL 样本+100μL 试剂一于 1.5mL EP 管中，混匀，静置 2min，加入 500μL 试剂二，混匀，于 520nm波长处测定管吸光值 A。

丙酮酸含量计算：

1、标准条件下测定回归方程为 y = 0.0466x + 0.0675； x 为丙酮酸含量（µg/mL），y 为吸光值。

2、按照血清（浆）体积计算

丙酮酸含量（μg/mL）= [(A-0.0675)÷0.0466×V1]÷（V3×V1÷V2）=214.6×(A-0.0675)

3、按照蛋白浓度计算

丙酮酸含量（μg/mg prot）=[(A-0.0675)÷0.0466×V1]÷(V1×Cpr)=21.46×(A-0.0675) ÷Cpr

4、按照样品质量计算

丙酮酸含量（µg/g 鲜重）= [(A-0.0675)÷0.0466×V1]÷(W ×V1÷V2）=21.46×(A-0.0675) ÷W

3、按照细菌或细胞密度计算

丙酮酸含量（μg/104cell）＝[(A-0.0675)÷0.0466×V1]÷（500×V1÷V2）=0.043×(A-0.0675)V1：加入反应体系中样本体积，0.3mL；V2：加入提取液体积，1 mL；V3：加入血清（浆）体积，0.1 mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。

注意：最低检测限为 1μg/mL 或 1μg/g 鲜重或 10ng/mg prot