乙酰胆碱酯酶（AchE）测试盒

注意：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

AchE 属于丝氨酸水解酶，广泛存在于各种动物组织和血清中。AchE 催化乙酰胆碱（Ach）水解，在神经传导调节中起重要作用。

测定原理：

AchE 催化 Ach 水解生成胆碱，胆碱与二硫对硝基苯甲酸（DTNB）作用生成 5-巯基-硝基苯甲酸（TNB）；TNB 在 412nm 处有吸收峰，通过测定 412 nm 吸光度增加速率，计算 AchE活性。

自备仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板、低温离心机、水浴锅、可调式移液枪和蒸馏水。

试剂组成和配制：

试剂一：液体×1 瓶，4℃保存。

试剂二：液体×1 瓶，4℃保存。

试剂三：粉剂×1 支，4℃保存。临用前加入 1.3 mL 试剂二，充分震荡溶解。

试剂四：粉剂×1 支，4℃保存。临用前加入 1.3 mL 试剂二，充分震荡溶解。

粗酶液提取：

1. 组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 试剂一）进行冰浴匀浆，8000g 4℃离心 10min，取上清液待测。

2. 细菌、真菌：按照细胞数量（104 个）：试剂一体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1mL 试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7秒，总时间 3min）；然后 8000g，4℃，离心 10min，取上清置于冰上待测。

3. 血清等液体：直接测定。

测定操作：

1. 分光光度计/酶标仪预热 30 min，调节波长到 412 nm，蒸馏水调零。

2. 试剂二置于 37℃水浴中预热 30min。

3. 取微量石英比色皿/96 孔板，依次加入 20μL 上清液、160 μL 试剂二、10μL 试剂三和 10μL试剂四，迅速混匀，于 412nm 处测定 3min 内吸光值变化，第 10s 吸光值记为 A1，第 190s吸光值记为 A2。△A 测定管=A2-A1。

注意：空白管只需测定一次。

AchE 活性计算：

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1. 组织 AchE 活性

（1）按照蛋白浓度计算

活性单位定义：每毫克蛋白每分钟催化产生 1nmol TNB 的酶量为 1 个酶活单位。

AchE 酶活(nmol/min/mg prot)= (△A÷ε÷d×V 反总×109)÷（Cpr ×V 样）÷T= 245×△A÷Cpr

（2）按照样本质量计算

活性单位定义：每克组织每分钟催化产生 1nmol TNB 的酶量为 1 个酶活单位。

AchE 酶活(nmol/min/g 鲜重)= (△A÷ε÷d×V 反总×109)÷（W ×V 样÷V 样总）÷T= 245×△A÷W

2. 细菌、细胞 AchE 活性

活性单位定义：每 104个细胞每分钟催化产生 1nmol TNB 的酶量为 1 个酶活单位。

AchE 酶活(nmol/min/104cell)= (△A÷ε÷d×V 反总×109)÷（细胞数量×V 样÷V 样总）÷T= 245×△A÷细胞数量

3. 血清 AchE 活性

活性单位定义：每毫升血清每分钟催化产生 1nmol TNB 的酶量为 1 个酶活单位。

AchE 酶活(nmol/min /mL)= (△A÷ε÷d×V 反总×109)÷V 样÷T=245×△Aε：TNB 摩尔消光系数，13.6×103L/mol/cm；d：比色皿光径，1 cm；V 反总：反应体系总体积（L），200μL=2×10-4L；V 样总：提取液体积，1 mL；106：1mol=1×106μmol；Cpr：蛋白浓度（mg/mL）；V 样：加入上清液体积（mL），0.02 mL；W ：样品质量；T：反应时间（min），3 min。

b.使用 96 孔板测定的计算公式如下

1. 组织 AchE 活性

（1）按照蛋白浓度计算

活性单位定义：每毫克蛋白每分钟催化产生 1nmol TNB 的酶量为 1 个酶活单位。

AchE 酶活(nmol/min/mg prot)= (△A÷ε÷d×V 反总×109)÷（Cpr ×V 样）÷T= 490×△A÷Cpr

（2）按照样本质量计算

活性单位定义：每克组织每分钟催化产生 1nmol TNB 的酶量为 1 个酶活单位。

AchE 酶活(nmol/min/g 鲜重)= (△A÷ε÷d×V 反总×109)÷（W ×V 样÷V 样总）÷T= 490×△A÷W

2. 细菌、细胞 AchE 活性

活性单位定义：每 104个细胞每分钟催化产生 1nmol TNB 的酶量为 1 个酶活单位。

AchE 酶活(nmol/min/104cell)= (△A÷ε÷d×V 反总×109)÷（细胞数量×V 样÷V 样总）÷T= 490×△A÷细胞数量

3. 血清 AchE 活性活性单位定义：每毫升血清每分钟催化产生 1nmol TNB 的酶量为 1 个酶活单位。

AchE 酶活(nmol/min /mL)= (△A÷ε÷d×V 反总×109)÷V 样÷T=490×△Aε：TNB 摩尔消光系数，13.6×103L/mol/cm；d：96 孔板光径，0.5 cm；V 反总：反应体系总体积（L），200μL=2×10-4L；V 样总：提取液体积，1 mL；106：1mol=1×106μmol；Cpr：蛋白浓度（mg/mL）；V 样：加入上清液体积（mL），0.02 mL；W ：样品质量；T：反应时间（min），3 min。