羧酸酯酶（CarE）测试盒

注意：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

哺乳动物 CarE，也称脂族酯酶（aliesterase），广泛分布于组织和器官，属于丝氨酸水解酶家族。CarE 催化含酯键、酰胺键和硫酯键的内源性与外源性物质水解，但不能催化水解乙酰胆碱及其类似物。CarE 参与脂质运输和代谢，并且与多种药物、环境毒物以及致癌物的解毒和代谢有关，有机磷农药可结合并且抑制 CarE 活性。

测定原理：

CarE 能催化乙酸-1-萘酯生成萘酯，固篮显色；在 450 nm 光吸收增加速率，计算 CarE 活性。

自备仪器和用品：

可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96 孔板、低温离心机、水浴锅、可调式移液枪和蒸馏水。

试剂组成和配置：

试剂一：液体×1 瓶，4℃保存。

试剂二：液体 15mL×2 瓶， 4℃保存；

试剂三：粉剂×2 支， 4℃保存，临用前取 1 支试剂三，加 0.6ml 无水乙醇充分溶解；

试剂四：粉剂×2 支，-20℃保存，临用前取 1 支试剂四，加少量试剂二溶解；

工作液配制：临用前配制，向 1 瓶试剂二中，加入溶解后的试剂三和试剂四各 1 支，充分溶解，过滤，4℃避光保存，可用 1 周。

粗酶液提取：

细菌、细胞样品制备收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每 200 万细菌或细胞加入 400μL 试剂一，超声波破碎细菌或细胞（功率 20％，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；12000g 4℃离心 30min，取上清液待测。

2、组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 试剂一）进行冰浴匀浆；12000g 4℃离心 30min，取上清液待测。

3、液体：直接测定

测定操作：

1. 分光光度计/酶标仪预热 30min，调节波长到 450 nm，蒸馏水调零。

2. 试剂二置于 37℃水浴中预热 30 min。

3. 空白管：取微量玻璃比色皿/96 孔板，依次加入 5μL 蒸馏水和 200μL 试剂二，迅速混匀，于 450nm 处测定 3min 内吸光值变化，第 10s 吸光值记为 A1，第 190s 吸光值记为 A2。△A空白管=A2-A1

4. 测定管：取微量玻璃比色皿/96 孔板，依次加入 5μL 上清液和 200μL 试剂二，迅速混匀，于 450nm 处测定 3min 内吸光值变化，第 10s 吸光值记为 A3，第 190s 吸光值记为 A4。△A测定管=A4-A3

注意：空白管只需测定一次。

CarE 活性计算公式：

a. 使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1 组织中 CarE 活性

（1） 按蛋白浓度计算

CarE 活性单位定义：每 mg 组织蛋白在 37℃反应体系中每分钟催化吸光值增加 1 定义为 1个酶活单位。

CarE 酶活(U/mg prot)= (△A 测定管-△A 空白管) ×V 反总÷(Cpr×V 样)÷T= 13.67×(△A 测定管-△A 空白管)÷Cpr

（2） 按样本鲜重计算

CarE 活性单位定义：每 g 组织在 37℃反应体系中每分钟催化吸光值增加 1 定义为 1 个酶活单位。

CarE 酶活(U/g 鲜重)= (△A 测定管-△A 空白管) ×V 反总×（V 样总÷V 样）÷W÷T=13.67×(△A 测定管-△ A 空白管)÷W

2 细菌或细胞中 CarE 活性

CarE 活性单位定义：每 1 万个细菌或细胞在 37℃反应体系中每分钟催化吸光值增加 1 定义为一个 CarE 活性单位。

CarE 酶活(U/104 cell)= (△A 测定管-△A 空白管) ×V 反总×（V 样总÷V 样）÷细胞密度（104cell/mL）÷T=13.67×(△A 测定管-△A 空白管)÷细胞密度（104

cell/mL）

3. 液体中 CarE 活性

CarE 活性单位定义：每毫升样品在 37℃反应体系中每分钟催化吸光值增加 1 定义为 1 个酶活单位。

CarE 酶活(U/mL )= (△A 测定管-△A 空白管) ×V 反总÷V 样÷T13.67×(△A 测定管-△A 空白管)V 反总：反应体系总体积，205μL=2.05×10-4L；V 样总：上清液总体积，1 mL；V 样：加入上清液体积(mL)，0.005 mL；Cpr：蛋白质浓度，mg/mL；W：样品质量（g）；T：反应时间（min），3min。

b. 使用 96 孔板测定的计算公式如下

1 组织中 CarE 活性

（3） 按蛋白浓度计算

CarE 活性单位定义：每 mg 组织蛋白在 37℃反应体系中每分钟催化吸光值增加 1 定义为 1个酶活单位。

CarE 酶活(U/mg prot)= (△A 测定管-△A 空白管) ×V 反总÷(Cpr×V 样)÷T= 13.67×(△A 测定管-△A 空白管)÷Cpr

（4） 按样本鲜重计算

CarE 活性单位定义：每 g 组织在 37℃反应体系中每分钟催化吸光值增加 1 定义为 1 个酶活单位。

CarE 酶活(U/g 鲜重)= (△A 测定管-△A 空白管) ×V 反总×（V 样总÷V 样）÷W÷T=13.67×(△A 测定管-△A 空白管)÷W

2 细菌或细胞中 CarE 活性

CarE 活性单位定义：每 1 万个细菌或细胞在 37℃反应体系中每分钟催化吸光值增加 1 定义为一个 CarE 活性单位。

CarE 酶活(U/104 cell)= (△A 测定管-△A 空白管) ×V 反总×（V 样总÷V 样）÷细胞密度（104cell/mL）÷T=13.67×(△A 测定管-△A 空白管)÷细胞密度（104

cell/mL）

3. 液体中 CarE 活性

CarE 活性单位定义：每毫升样品在 37℃反应体系中每分钟催化吸光值增加 1 定义为 1 个酶活单位。

CarE 酶活(U/mL )= (△A 测定管-△A 空白管) ×V 反总÷V 样÷T=13.67×(△A 测定管-△A 空白管)V 反总：反应体系总体积，205μL=2.05×10-4L；V 样总：上清液总体积，1 mL；V 样：加入上清液体积(mL)，0.005 mL；Cpr：蛋白质浓度，mg/mL；W：样品质量（g）；T：反应时间（min），3min。