吡咯啉-5-羧酸还原酶（P5CR）测试盒

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

吡咯啉-5-羧酸还原酶( P5CRs) 是普遍存在于原核和真核生物中的一类重要的管家蛋白。其主要功能是催化脯氨酸生物合成的最后一步反应，将吡咯啉-5-羧酸( P5C) 转化为脯氨酸，在调节细胞凋亡等一系列病理和生理过程中起着重要作用。

测定原理：

P5CR 具有噻唑烷-4-羧酸脱氢酶活性，催化噻唑烷-4-羧酸的脱氢反应，同时将 NAD 转化为NADH，测定 340nm 下吸光值增加速率来反映酶的活性。

需自备的仪器和用品：

酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂组成和配制：

提取液：液体 100mL×1 瓶，4℃保存；

试剂一：液体 25mL×1 瓶，4℃保存；

试剂二：粉剂×2 瓶，-20℃保存；

粗酶液提取：

细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30次）；12000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆。12000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

测定步骤：

1、 酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 340nm。

2、 样本测定

（1）在试剂二中加入 10mL 试剂一充分溶解混匀，现配现用；

（2）在 96 孔板中加入 10μL 样本和 190μL 试剂二，混匀，立即记录 340nm 处 10s 时的吸光值 A1 和 2min10s 时的吸光值 A2，计算 ΔA=A2-A1。

P5CR 活性计算：

1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟产生 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。

P5CR（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=3215×ΔA÷Cpr

（2）按样本鲜重计算：

单位的定义：每 g 组织每分钟产生 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

P5CR（nmol/min/g 鲜重）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(W× V 样÷V 样总) ÷T=3215×ΔA÷W

（3）按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟产生 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

P5CR（nmol/min/104 cell）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(500×V 样÷V 样总)÷T=6.43×ΔAV 反总：反应体系总体积，2×10-4 L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：96孔板光径，0.5cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，2 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。