鸟氨酸转氨酶（OAT）测试盒

注意：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

测定意义

脯氨酸是植物体内适应逆境胁迫的一种重要的渗透调节物质。高等植物中脯氨酸代谢因其初始底物不同，分为谷氨酸( Glu) 和鸟氨酸( Orn) 两条合成途径。鸟氨酸转氨酶( δ-OAT) 是是以鸟氨酸为前体合成脯氨酸途径的关键酶，对植物适应逆境胁迫起关键作用。

测定原理

鸟氨酸和α-酮戊二酸在鸟氨酸转氨酶和 NADH 作用下发生氨基转移反应生成吡咯啉-5-羧酸（P5C），同时产生 NAD，通过检测 340nm 处的吸光度的变化可反映出鸟氨酸转氨酶活性的高低。

自备实验用品及仪器

天平、低温离心机、研钵、紫外可见分光光度计、1mL 石英比色皿。

试剂组成和配制

提取液：液体 55mL×1 瓶，4℃保存。

试剂一：液体 70 mL×1 瓶，4℃保存。

试剂二：粉剂×1 瓶，4℃保存；临用前加 20mL 试剂一充分溶解；用不完的试剂 4℃保存。

试剂三：粉剂×1 瓶，4℃保存；临用前加 20mL 试剂一充分溶解；用不完的试剂 4℃保存。

试剂四：粉剂×2 瓶，-20℃保存；临用前每瓶加 10mL 试剂一充分溶解；现配现用。

酶液提取

1. 组织：按照质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g，加入 1mL提取液）加入提取液，冰浴匀浆后于 4℃，10000g 离心 10min，取上清置冰上待测。

2. 细胞：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500万细胞加入 1mL 提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；然后 4℃，10000g 离心 10min，取上清置冰上待测。

3. 液体：直接检测。

测定操作

1. 分光光度计预热 30min，调节波长至 340nm。

2. 将配好的试剂二、三、四 37℃预热 5min。（注意：粉剂试剂需要自行配制）

3. 取 1mL 石英比色皿，依次加入 300μL 试剂二，300μL 试剂三，300μL 试剂四，100μL 粗酶液，充分混匀，记录 340nm 处初始吸光值和 37℃反应 10min 的吸光值 A2，△A=A1-A2。

计算公式

（1）按照样本蛋白浓度计算

酶活单位定义：每毫克组织蛋白每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。

δ-OAT（nmol/min /mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V 反总÷(V 样×Cpr) ÷T=160.77×ΔA÷Cpr

（2）按照样本质量计算

酶活单位定义：每克组织每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。

δ-OAT（nmol/min /g 鲜重）=ΔA÷（ε×d）×V 反总÷(W ×V 样÷V 样总) ÷T=160.77×ΔA÷W

（3）按照细胞数量计算

酶活单位定义：每 104 个细胞每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。

δ-OAT（nmol/min /104 cell）= ΔA÷（ε×d）×V 反总÷(V 样×细胞数量÷V 样总) ÷T=160.77×ΔA÷细胞数量

（4）按照液体体积计算

酶活单位定义：每毫升液体每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。

δ-OAT（nmol/min /mL）＝ΔA÷（ε×d）×V 反总÷V 样÷T=160.77×ΔAV 反总：反应体系总体积，1mL；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.1mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，10 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g