天冬酰胺合成酶

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

天冬酰胺合成酶是广泛存在于生物体内的一类氨基转移酶，催化谷氨酰胺的氨基向天冬氨酸转移。当植物处于氨毒时天冬酰胺的形成是一种解毒反应。

测定原理：

AS 催化 L-天冬酰胺水解成 L-天冬氨酸和氨，利用奈氏试剂检测氨增加的速率，即可计算其酶活性。

需自备仪器和用品：

台式离心机、可见分光光度计、水浴锅、1mL 玻璃比色皿、可调式移液枪、研钵、冰和蒸馏水。

试剂组成和配制：

试剂一：液体 60mL×1 瓶，4 ℃保存；

试剂二：粉剂×2 瓶，4 ℃避光保存；临用前每瓶加入 12.5mL 蒸馏水充分溶解待用，现配现用；

试剂三：液体 30 mL×1 瓶，常温保存；

试剂四：液体 10 mL×1 瓶，常温保存；

试剂五：液体 6 mL×1 瓶，常温保存；

试剂六：液体6 mL×1瓶，常温避光保存。

粗酶液提取：

1、细菌、细胞或组织样品的制备：

细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104 个）：试剂一体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 试剂一），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL试剂一），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

2、血清（浆）样品：直接检测。

测定步骤：

1、分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 420nm，蒸馏水调零。

2、样品测定（在 EP 中加入下列试剂）：

混匀，室温静置 15min，420nm 处读取吸光值 A，计算 ΔA=A 测定管-A 对照管。对照管只要做一管

注意：

1、试剂六如出现沉淀，静置后取上清使用。

2、ΔA（A 测定管-A 对照管）若出现负值，可能是酶活性较低，可将反应时间 1h 延长到 2h，相应的在计算公式中除以 2。

酶活性计算：

标准条件下测定的回归方程为 y =3.8488x +0.0057，R2 = 0.9983；；x 为标准品浓度（μmol/mL），y 为吸光值 A。

1、血清（浆）AS 活性

单位定义：每 mL 血清（浆）每 min 催化谷氨酰胺生成 1nmol 氨定义为一个酶活力单位。

AS（nmol /min /mL）＝ (ΔA-0.0057) ÷3.8488×V 反总÷V 样÷T×1000=181.8×(ΔA -0.0057)

2、组织、细菌或细胞 AS 活性

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位定义：每 mg 蛋白质每 min 催化谷氨酰胺生成 1nmol 氨定义为一个酶活力单位。

AS（nmol /min /mg prot）＝ (ΔA-0.0057) ÷3.8488×V 反总÷(V 样×Cpr)÷T×1000=181.8×(ΔA -0.0057)÷Cpr

（2）按样本鲜重计算：

单位定义：每 g 组织每 min 催化谷氨酰胺生成 1nmol 氨定义为一个酶活力单位。

AS（nmol/min/g 鲜重）＝(ΔA-0.0057)÷3.8488×V 反总÷(W×V 样÷V 样总)÷T×1000=181.8×(ΔA -0.0057)÷W

（3）按细菌或细胞密度计算

单位定义：每 1 万个细菌或细胞每 min 催化谷氨酰胺生成 1nmol 氨定义为一个酶活力单位。

AS（nmol/min/104 cell）＝(ΔA-0.0057) ÷3.8488×V 反总÷(500× V 样÷V 样总)÷T×1000=0.3637×(ΔA-0.0057)V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，60min；V 反总：反应体系总体积，1.05mL；V 样：加入反应体系中样本体积，0.025mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万; 1000，μmol 到 nmol 换算系数。