过氧化氢酶（CAT）测试盒（紫外吸收法）

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

CAT(EC 1.11.1.6)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是最主要的 H2O2 清除酶，在活性氧清除系统中具有重要作用。

测定原理：

H2O2在 240nm 下有特征吸收峰，CAT 能够分解 H2O2，使反应溶液 240nm 下的吸光度随反应时间而下降，根据吸光度的变化率可计算出 CAT 活性。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1mL 石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水

试剂组成和配制：

提取液：60mL×1 瓶，4℃保存；

工作液：60mL×1 瓶，4℃保存；

粗酶液提取：

1、细菌、细胞或组织样品的制备：

细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

2、血清（浆）样品：直接检测。

测定步骤：

1、分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 240nm 处，蒸馏水调零。

2、测定前将 CAT 检测工作液 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴 10min。

3、在 1mL 石英比色皿中加入 35μL 样本和 1mL 工作液，混匀，室温下立即测定 240nm 下的初始吸光值 A1 和 1min 后的吸光值 A2，计算 ΔA=A1-A2

注意事项：出现负值怎么办？检查反应过程是否产生气泡，气泡多说明酶活性太高，气泡影响产生了负值，可以将样本用提取液稀释 10 倍后再检测。如果稀释样本或反应体系没有产生气泡仍然出现较小的负值，说明该样本测不到该酶活。

CAT 活性计算：

1、血清（浆）CAT 活力的计算:

单位的定义：每毫升血清（浆）每分钟催化 1nmol H2O2 降解定义为一个酶活力单位。

CAT(nmol/min/mL)= [ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷V 样÷T=678×ΔA

2、组织、细菌或细胞中 CAT 活力计算：

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟催化 1nmol H2O2降解定义为一个酶活力单位。

CAT(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=678×ΔA÷Cpr

（2）按样本鲜重计算：

单位的定义：每 g 组织每分钟催化 1nmol H2O2降解定义为一个酶活力单位。

CAT(nmol/min /g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(W× V 样÷V 样总)÷T=678×ΔA÷W

（3） 按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟催化 1nmol H2O2降解定义为一个酶活力单位。

CAT(nmol/min /104 cell)＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷（500×V 样÷V 样总）÷T =1.356×ΔAV 反总：反应体系总体积，1.035×10-3 L；ε：H2O2摩尔消光系数，4.36×104 L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.035 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，1 min；W：样本质量，g；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；500：细胞或细菌总数，500 万。