硫氧还蛋白过氧化物酶（TPX）测试盒

注意：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

TPX 属于过氧化物酶家族，在体内主要通过还原过氧化氢和一些氢过氧化物来实现抗氧化作用，功能与 GPX 类似，也是谷胱甘肽氧化还原循环关键酶之一。TPX 普遍存在于各种生物体内，如酵母、植物、动物、原生动物、寄生虫、细菌和古细菌，在进化上高度保守。TPX 与细胞增殖、分化、细胞凋亡及肿瘤发生调控密切相关。TPX 的主要功能包括细胞脱毒、抗氧化和调节由过氧化氢介导的信号转导和免疫反应。

测定原理：

TPX 催化 H2O2氧化二硫苏糖醇（DTT），H2O2的吸收波长为 240nm，通过测定 240nm 吸光度的下降速率，即可计算出 TPX 活性。

自备仪器和用品:

紫外分光光度计、低温离心机、水浴锅、可调节移液器、1mL 石英比色皿和蒸馏水

试剂组成和配制:

试剂一：液体 50mL×1 瓶，室温保存。

试剂二：液体 50mL×1 瓶，- 20℃保存。

试剂三：液体 5mL×1 瓶，4℃。

粗酶液提取：

1. 组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 试剂一）进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心 10min，取上清置冰上待测。

2. 细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1mL 试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7秒，总时间 3min）；然后 8000g，4℃，离心 10min，取上清置于冰上待测。

3. 血清等液体：直接测定。

TPX 测定操作：

1. 分光光度计预热 30min，调节波长到 240 nm，蒸馏水调零。

2.试剂二置于 25℃（一般物种）或者 37℃（哺乳动物）水浴预热 30 min。

3.取 1mL 石英比色皿，加入 20 μ L 上清液，900 μ L 试剂二，80 μ L 试剂三，迅速混匀后于240 nm 测定 10 s 和 130 s 吸光度，记为 A1 和 A2。

TPX 活性计算公式：

(1). 按蛋白浓度计算

活性单位定义：25℃或者 37℃中，每毫克蛋白每分钟催化 1nmol H2O2降解为 1 个酶活单位。

TPX 活性（nmol/min /mg prot）=(A1－A2)÷ε÷d×V 反总÷（Cpr×V 样）÷T=573×(A1－A2)÷Cpr

(2). 按样本质量计算

活性单位定义：25℃或者 37℃中，每克样本每分钟催化 1nmol H2O2降解为 1 个酶活单位。

TPX 活性（nmol/min/g 鲜重）=(A1－A2)÷ε÷d×V 反总÷(W×V 样÷V 样总)÷T=573×(A1－A2)÷W

（3）按细胞数量计算

活性单位定义：25℃或者 37℃中，每 104个细胞每分钟催化 1nmol H2O2降解为 1 个酶活单位。

TPX 活性（nmol/min/104 cell）=(A1－A2)÷ε÷d×V 反总÷(细胞数量×V 样÷V 样总)÷T=573×(A1－A2)÷细胞数量

（4）按液体体积计算

活性单位定义：25℃或者 37℃中，每毫升液体每分钟催化 1nmol H2O2降解为 1 个酶活单位。

TPX 活性（nmol/min /mL）=(A1－A2)÷ε÷d×V 反总÷V 样÷T=573×(A1－A2)ε：H2O2的摩尔消光系数，43600 L/mol/cm=0.0436 L/μmol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 反总：反应体系总体积（L），1000 μ L=0.001 L；Cpr：上清液蛋白质浓度（mg/mL）；V 样：加入反应体系中上清液体积（mL），20 μ L=0.02 mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；W，样本质量，g；T：反应时间（min），2min。