单宁酶（TAN）试剂盒

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义

单宁酶全称是单宁酯酰水解酶(Tannase，EC 3.1.1.20)，它可以水解没食子酸单宁中的酯键和缩酚羧键，生成没食子酸和葡萄糖。

测定原理

使用抗氧化剂没食子酸丙酯（PG）作为单宁酶酶促反应的底物，在 270nn 下测定底物 PG反应前后的光密度变化,计算单宁酶酶活力。

需自备的的仪器和用品

紫外分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL 石英比色皿、研钵、冰、蒸馏水

试剂的组成和配制

试剂一：液体 100mL×1 瓶，4℃保存；

试剂二：粉剂×1 支，4℃保存；临用前每支加入 3mL 试剂一，充分溶解后备用；用不完的试剂 4℃保存；

粗酶液提取

按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL试剂一），进行冰浴匀浆。10000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

测定步骤

1、分光光度计预热 30min 以上，调节波长到 270 nm，蒸馏水调零。

2、加样表

混匀，270nm 处读取各管吸光值。计算ΔA=A 对照-A 测定。每个测定管需设个一个对照管。

注意：

可以在不同对照管中加入不同样品的粗酶液，然后集中进行 5min 95℃沸水浴处理。

TAN 活力单位的计算

标准条件下测定回归方程为 y = 0.0058x + 0.0044，R2 = 0.9994；x 为 PG 含量（µmol/L），y为吸光值。

1、按样本体积计算

单位的定义：40℃下每毫升粗酶液每分钟水解减少 0.01µmol 底物 PG 所需要的酶量定义为一个酶活单位。

TAN 活性(µmol/min/mL)=(ΔA-0.0044）÷0.0058÷1000×V 反总÷0.01÷V 样÷T=34.48×( ΔA-0.0044）

2、按照蛋白浓度计算

单位的定义：40℃下每毫克蛋白每分钟水解减少 0.01µmol 底物 PG 所需要的酶量定义为一个酶活单位(U)。

TAN 活性((µmol/min/mg prot)=(ΔA-0.0044）÷0.0058÷1000×V 反总÷0.01÷(V 样×Cpr)÷T=34.48×(ΔA-0.0044）÷Cpr

3、按照样本鲜重计算

单位的定义：40℃下每克样品每分钟水解减少 0.01µmol 底物 PG 所需要的酶量定义为一个酶活单位(U)。

TAN 活性(µmol/min/g 鲜重)=(ΔA-0.0044）÷0.0058÷1000×V 反总÷0.01÷(V 样÷V 样总×W)÷T=34.48×(ΔA-0.0044）÷WV 反总：反应体系总体积，1mL； V 样：加入样本体积，0.05mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，10min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g。