单脱氢抗坏血酸还原酶（MDHAR）测试盒

注意：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

MDHAR 催化 MDHA 还原生成 AsA，在抗坏血酸氧化还原代谢中具有重要作用。

 测定原理：

MDHAR 催化 NADH 还原 MDHA 生成 AsA 和 NAD+，NADH 在 340 nm 有特征吸收峰，但是 NAD+没有。通过测定 340 nm 光吸收下降速率，来计算出 MDHAR 活性。

实验中所需仪器及设备：

研钵、冰、台式离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板、可调式移液枪和双蒸水

试剂组成和配置：

试剂一：液体 100mL×1 瓶，4℃保存。

试剂二：液体 20mL×1 瓶，室温保存。

试剂三：粉剂×1 瓶（棕色），4℃保存。临用前加入 3 mL 蒸馏水充分溶解。

试剂四：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前加入 2.5 mL 蒸馏水充分溶解。

试剂五：液体 15μL×1 瓶，4℃保存。临用前加 3 mL 试剂二充分溶解。

 粗酶液提取：

1. 组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 试剂一）进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心 10min，取上清置冰上待测。

2. . 细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1mL 试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7秒，总时间 3min）；8000g ，4℃离心 20min，取上清液置冰上混匀待测。

3. 血清等液体：直接测定。

 MDHAR 测定操作：

1. 分光光度计/酶标仪预热 30 min，调节波长到 340 nm，蒸馏水调零。

2. 试剂二在 25℃水浴锅中预热 30 min。

3.依次在微量石英比色皿/96 孔板中加入 20μL 试剂三、20μL 试剂四、20μL 试剂五和 120μL试剂二，最后加入 20μL 上清液，迅速混匀后于 340nm 比色，记录 30s 和 150s 的吸光值 30s和 150s 的吸光值 A1 和 A2，△A=A1-A2。 

MDHAR 活性计算公式：

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

(1). 按蛋白浓度计算

MDHAR 活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟氧化 1nmol NADH 为 1 个酶活单位。

MDHAR (nmol/min /mg prot) = △A÷ε÷d×V 反总×109]÷（Cpr×V 样）÷T= 804×△A ÷Cpr

(2). 按样本质量计算

MDHAR 活性单位定义：25℃中每克样本每分钟氧化 1nmol NADH 为 1U。

MDHAR (nmol/min /g 鲜重) = △A÷ε÷d×V 反总×109]÷（W×V 样÷V 样总）÷T= 804×△A ÷W

（3）按细胞数量计算

MDHAR 活性单位定义：25℃中每 10

4个细胞每分钟氧化 1nmol NADH 为 1 个酶活单位。

MDHAR (nmol/min/104 cell) = △A÷ε÷d×V 反总×109÷（细胞数量×V 样÷V 样总）÷T= 804×△A ÷ 细胞数量

（4）按液体体积计算

MDHAR 活性单位定义：25℃中每毫升液体每分钟氧化 1nmol NADH 为 1 个酶活单位。

MDHAR (nmol/min /mL) = △A÷ε÷d×V 反总×109÷V 样）÷T= 804×△Aε：NADH 摩尔消光系数，6220 L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 反总：反应体系总体积，0.2mL=2×10-4L；V 样：加入反应体系中上清液体积，20μL=0.02mL；V 样总：提取液体积，1 mL；Cpr：上清液蛋白浓度，mg/mL，蛋白质浓度需要另外测定，建议使用本公司蛋白质含量 BCA 试剂盒；W ：样品质量；T：反应时间，2min。

b.使用 96 孔板测定的计算公式如下：

(1). 按蛋白浓度计算

MDHAR 活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟氧化 1nmol NADH 为 1 个酶活单位。

MDHAR (nmol/min /mg prot) = △A÷ε÷d×V 反总×109]÷（Cpr×V 样）÷T= 1608×△A ÷Cpr

(2). 按样本质量计算

MDHAR 活性单位定义：25℃中每克样本每分钟氧化 1nmol NADH 为 1U。

MDHAR (nmol/min /g 鲜重) = △A÷ε÷d×V 反总×109]÷（W×V 样÷V 样总）÷T= 1608×△A ÷W

（3）按细胞数量计算

MDHAR 活性单位定义：25℃中每 104个细胞每分钟氧化 1nmol NADH 为 1 个酶活单位。

MDHAR (nmol/min/104 cell) = △A÷ε÷d×V 反总×109÷（细胞数量×V 样÷V 样总）÷T= 1608×△A ÷ 细胞数量

（4）按液体体积计算

MDHAR 活性单位定义：25℃中每毫升液体每分钟氧化 1nmol NADH 为 1 个酶活单位。

MDHAR (nmol/min /mL) = △A÷ε÷d×V 反总×109÷V 样）÷T=1608×△Aε：NADH 摩尔消光系数，6220 L/mol/cm；d：96 孔板光径，0.5cm；V 反总：反应体系总体积，0.2mL=2×10-4L；V 样：加入反应体系中上清液体积，20μL=0.02mL；V 样总：提取液体积，1 mL；Cpr：上清液蛋白浓度，mg/mL，蛋白质浓度需要另外测定，建议使用本公司蛋白质含量 BCA 试剂盒；W ：样品质量；T：反应时间，2min。

注意事项：

临用前配制的试剂未使用完的 4℃保存，3 天内使用完。