氧化型谷胱甘肽（GSSG）含量测试盒

注意：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

GSH/GSSG 是细胞内最重要的氧化还原对之一。因此，测定细胞内 GSH 和 GSSG 含量以及GSH/GSSG 比值，能够很好地反映细胞所处的氧化还原状态，也是谷胱甘肽氧化还原循环的主要指标之一。

测定原理：

利用 2-VP 法测 GSSG 含量。

自备仪器和用品：

低温离心机、水浴锅、可调节移液器、可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96 孔板、和蒸馏水。

试剂组成和配置：

试剂一：液体 100mL×1 瓶，4℃保存。

试剂二：液体 600μL×1 支，4℃保存。

试剂三：液体 50mL×1 瓶，4℃保存。

试剂四：液体 2.5mL×1 瓶，4℃保存。

试剂五： 液体 15μL×1 瓶，-20℃保存。临用前加入 0.3mL 试剂三稀释，4℃保存。

试剂六：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前加入 20 mL 试剂三溶解，现配现用。

粗酶液提取：

1. 组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 试剂一）进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清液（如上清不清澈，再离心 3min）待测。

2. 细菌、真菌：按照细胞数量（104 个）：试剂一体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议500 万细胞加入 1mL 试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；8000g 4℃离心 10min，取上清液（如上清不清澈，再离心 3min）混匀待测。

3. 血清等液体：直接测定。

GSSG 含量测定：

1. 分光光度计/酶标仪预热 30min，调节波长到 412nm，蒸馏水调零。

2. 试剂三置于 25℃（一般物种）或者 37℃（哺乳动物）水浴中保温 30min。

3.取 1 mL EP 管，加入 100μ L 上清液，5 μ L 试剂二，盖紧后混匀，得混合液，置于 25℃或37℃水浴 30min；取 21μ L 混合液于 96 孔板，然后依次加入 20 μ L 试剂四、2 μ L 试剂五和140 μ L 试剂六，迅速混匀后，测定 30 s 和 150 s 光吸收 A1 和 A2，计算ΔA=A2-A1。

GSSG 含量计算公式：

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1、标准条件下测定的回归方程为 y=0.0276x-0.0011；x 为标准品浓度（nmol/mL），y 为吸光值(ΔA)。

2、 按蛋白浓度计算

GSSG（nmol/mg prot）=(ΔA+0.0011)÷0.0276×V 样÷(V 样×Cpr)=36.23×(ΔA+0.0011)÷Cpr

3、按样本鲜重计算

GSSG（nmol /g 鲜重）=(ΔA+0.0011)÷0.0276×V 样÷(V 样÷V 样总×W)=36.23×(ΔA+0.0011)÷W

4、按细胞数量计算

GSSG（nmol/104 cell）=(ΔA+0.0011)÷0.0276×V 样÷(V 样÷V 样总×细胞数量)=36.23×(ΔA+0.0011)÷细胞数量

5、按照液体体积计算

GSSG（nmol/mL）=(ΔA+0.0011)÷0.0276×V 样÷V 样=36.23×(ΔA+0.0011)V 样：反应中加入样本体积，20μL；V 样总：加入提取液体积， 1mL；W：样品质量，g，Cpr：样本蛋白浓度（mg/mL）

b.使用 96 孔板测定的计算公式如下

1、标准条件下测定的回归方程为 y=0.0138x-0.0011；x 为标准品浓度（nmol/mL），y 为吸光值(ΔA)。

2、 按蛋白浓度计算

GSSG（nmol/mg prot）=(ΔA+0.0011)÷0.0138×V 样÷(V 样×Cpr)=72.46×(ΔA+0.0011)÷Cpr

3、按样本鲜重计算

GSSG（nmol /g 鲜重）=(ΔA+0.0011)÷0.0138×V 样÷(V 样÷V 样总×W)=72.46×(ΔA+0.0011)÷W

4、按细胞数量计算

GSSG（nmol/104 cell）=(ΔA+0.0011)÷0.0138×V 样÷(V 样÷V 样总×细胞数量)=72.46×(ΔA+0.0011)÷细胞数量

5、按照液体体积计算

GSSG（nmol/mL）=(ΔA+0.0011)÷0.0138×V 样÷V 样=72.46×(ΔA+0.0011)V 样：反应中加入样本体积，20μL；V 样总：加入提取液体积， 1mL；W：样品质量，g，Cpr：样本蛋白浓度（mg/mL）

注意事项：

1. 提取过程中去掉蛋白质，所以提取液不能用于测定蛋白含量。

2. 临用前配制的试剂配好后 4℃保存，2 天内使用完毕。

3. 最低检出限为 0.1μmol/L。

4. 反应温度严格来说，为保证重复性，应在 25℃下进行反应。

5. 反应时间需精确控制，否则会影响反应速率计算，产生较大误差。

6. 样品中的 GSSG 浓度尽可能低一些，否则反应速率太大，没法控制，所以稀释倍数要尽量大些。