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异柠檬酸裂解酶(ICL)测试盒 BES-BK2001A

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异柠檬酸裂解酶(ICL)测试盒 BES-BK2001A

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义:ICL(EC4.1.3.1)主要存在于植物和微生物中,油料作物种子在萌发过程中,通过乙醛酸循环及其他过程将脂肪转变成碳水化合物。ICL 是乙醛酸循环的关键酶之一。

测定原理:ICL 催化异柠檬酸降解为乙醛酸和琥珀酸,乙醛酸和 NADH 在 LDH 的作用下生成乙醇和NAD,NADH 在 340nm 下有特征吸收峰,监测 340nm 吸光度的减小速率可间接反应 ICL 活性。

需自备的仪器和用品:紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水

试剂组成和配制:

提取液:液体 100mL×1 瓶,4℃保存;

试剂一:液体 15mL×1 瓶,4℃保存;

试剂二:粉剂×1 瓶,-20℃保存;

试剂三:液体 360μL×1 支,4℃保存;

试剂四:粉剂×1 瓶,4℃保存;

样本的前处理:

1、细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次);15000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

2、组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液),进行冰浴匀浆。15000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

测定步骤:

1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 340nm,蒸馏水调零。

2、 样本测定

(1)工作液的配置,将试剂二和试剂三转移至试剂一中,充分混合溶解,置于 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)水浴 5min;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融;

(2)在试剂四中加入 4mL 蒸馏水,充分溶解待用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融;

(3)在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μL 样本、150μL 工作液和 40μL 试剂四,混匀,立即记录 340nm 处 20s 时的吸光值 A1 和 2min20s 后的吸光值 A2,计算 ΔA=A1-A2。

ICL 活性计算:

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下

(1)按样本蛋白浓度计算:单位的定义:每 mg 组织蛋白中每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。ICL(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=1608×ΔA÷Cpr

(2)按样本鲜重计算: 单位的定义:每 g 组织每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。ICL(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(W× V 样÷V 样总) ÷T=1608×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞密度计算:单位的定义:每 1 万个细菌或细胞每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。ICL(nmol/min/104cell)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T=3.215×ΔAV 反总:反应体系总体积,2×10-4L;ε:NADH 摩尔消光系数,6.22×103L / mol /cm;d:比色皿光径,1cm;V 样:加入样本体积,0.01 mL;V 样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,2 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500 万。

b.用 96 孔板测定的计算公式如下

(1)按样本蛋白浓度计算:单位的定义:每 mg 组织蛋白中每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。ICL(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=3216×ΔA÷Cpr

(2)按样本鲜重计算:单位的定义:每 g 组织每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。ICL(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(W ×V 样÷V 样总) ÷T=3216×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞密度计算:单位的定义:每 1 万个细菌或细胞每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。ICL(nmol/min /104cell)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T=6.25×ΔAV 反总:反应体系总体积,2×10-4L;ε:NADH 摩尔消光系数,6.22×103L / mol /cm;d:96 孔板光径,0.5cm;V 样:加入样本体积,0.01 mL;V 样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,2 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500 万。

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