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组织细胞 辅酶Ⅱ(NADP+/NADPH)检测试剂盒(WST-8法) BES-BK2801B

Histiocyte Coenzyme II (NADP+/NADPH) Detection Kit (WST-8 Method)

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组织细胞 辅酶Ⅱ(NADP+/NADPH)检测试剂盒(WST-8法)


产品说明:

NADP/NADPH检测试剂盒(NADP/NADPH Assay Kit)是一种特异灵敏的检测总烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)或还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)的试剂盒。NADP在细胞内以两种化学型存在,NADP+是氧化型,NADPH是还原型。在氧化还原反应中,NADP+作为氢和电子的受体,NADPH作为氢和电子的供体,在糖酵解等生理过程中发挥重要作用。

本试剂盒利用NADPH与CCK-8试剂反应生成NADP+和甲赞(Formazan),通过测定甲赞450nm吸光度定量测定NADPH浓度。在该检测反应中,同时加入葡萄糖-6-磷酸(Glucose-6-phosphate, G-6-P)和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(Glucose-6-phosphate dehydrogenase, GDH),可以将生成的NADP+还原为NADPH,使检测反应成为循环反应,在G-6-P、CCK-8和GDH过量的条件下,生成的甲赞与NADP+和NADPH总量(NADP)成正相关,从而定量检测NADP浓度。在样本经过加热分解NADP+后,可以定量检测NADPH浓度。

检测反应示意图如下:

本试剂盒具有良好的检测线性,检测NADP/NADPH的线性范围为0.078-5μM,灵敏度≤0.078μM。

本试剂盒能够检测细胞培养上清、细胞裂解上清、组织裂解上清、血浆和血清中的NADP/NADPH。


试剂盒组成

组份名称

规格

数量

储存

Lysis Buffer

50ml/瓶

1

-20℃

NADP/NADPH Assay Buffer

5 ml/瓶

1

-20℃

G-6-P Solution

0.6 ml/管

1

-20℃

GDH Solution

60 μl/管

1

-20℃

CCK-8 Solution

1 ml/管

1

-20℃

NADPH Standard (1mM)

250 μl/管

1

-80℃


储存条件

干冰运输,收到试剂盒后按将试剂盒不同组分按上述温度储存,有效期12个月。


注意事项

1. 每次测定时利用标准品制作标准曲线。

2. 实验过程中,除裂解液和检测缓冲液外,其它试剂请置于冰上。

3. 本产品仅限专业人员用于科学研究,不得用于临床诊断或治疗,不得用于食品或药品。


测定前准备

1. 样品的准备

1.1 细胞裂解上清的准备:将需要测定的细胞(1×106-1×107)收集到2ml的离心管中,4℃、300g离心5分钟,弃去上清,然后加入200μl的Lysis Buffer,冰浴裂解30min,4℃、10000g离心10分钟,收集上清。

1.2 组织裂解上清的准备:将需要测定的组织(20-50mg)收集到玻璃匀浆器或自动匀浆管中,然后加入0.5ml的Lysis Buffer,匀浆1min,4℃、10000g离心10分钟,收集上清。

1.3 NADPH测定样品的准备:将上述样本,60℃孵育30min,使NADP+分解后,用于NADPH测定。

2. 试剂盒的准备

NADP/NADPH检测工作液的配制:根据待测样品数参考下表配制适当量的NADP/NADPH检测工作

液,表中试剂按比例混合后即为NADP/NADPH检测工作液。


1个样品

10个样品

50个样品

NADP/NADPH Assay Buffer

34.5 μl

0.345 ml

1.725 ml

G-6-P Solution

5 μl

50 μl

250 μl

GDH Solution

0.5 μl

5 μl

25 μl

CCK-8 Solution

10 μl

100 μl

500 μl

3. 标准品的准备

在1.5 ml离心管中,加入995μl纯水或Lysis Buffer,再取5μl的1mM浓度NADPH标准品加入离心管中配制5μM浓度NADPH标准品;然后取另外6根1.5 ml离心管,分别加入500μl或Lysis Buffer,再吸取500μl的5μM浓度NADPH标准品依次倍倍稀释为2.5、1.25、0.625、0.312、0.156、0.078μM浓度。


测定方法

1. 参考下表,使用透明96孔板,依次加入标准品或样品、NADP/NADPH检测工作液,混匀,室温孵育10-20分钟。


空白对照孔

标准曲线孔

样品孔

纯水或Lysis Buffer

50 μl

NADPH标准品

50 μl

样品

50 μl

NADP/NADPH检测工作液

50 μl

50 μl

50 μl

2. 待反应完成后,利用酶标仪测定相对发光强度450nm波长的吸光度,如果样本中NADP/NADPH浓度偏低,可以适当延长反应时间。


用途:该产品仅供科研实验使用,未经允许不得用于其它用途!


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