山梨醇脱氢酶测试盒

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

SH（EC 1.1.1.14）催化山梨醇脱氢生成果糖，是调控生物体内山梨醇含量的关健酶之一。

测定原理：

SH 催化山梨醇脱氢生成果糖，同时还原 NAD+生成 NADH，测定 340nm 吸光度增加速率可以计算 SH 活性。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL 石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂组成和配制：

提取液：液体 60mL×1 瓶，4℃保存；

试剂一：液体 20mL×1 瓶，4℃保存；

试剂二：粉剂×1 瓶，4℃保存；临用前每瓶加入 15mL 蒸馏水，用不完的试剂仍 4℃保存。

试剂三：粉剂×1 瓶，-20℃保存；临用前每瓶加入 15mL 蒸馏水，用不完的试剂仍-20℃保存。

粗酶液提取：

1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

3、血清（浆）样品：直接检测。

测定步骤：

1、 分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。

2、 样本测定

将上述试剂按顺序加入 1 mL 玻璃比色皿中，加样本的同时开始计时，记录 20 秒时的初始吸光度 A1 和 2 分 20 秒时的吸光度 A2，计算 ΔA=A2-A1。

SH 活性计算：

1、血清（浆）SH 活力的计算

单位的定义：每毫升血清（浆）每分钟生成 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

SH（nmol/min/mL）= [ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷V 样÷T=1688×ΔA

2、组织、细菌或细胞中 SH 活力的计算:

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟生成 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

SH（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=1688×ΔA÷Cpr

（2）按样本鲜重计算：

单位的定义：每 g 组织每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

SH（nmol/min/g 鲜重）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(W× V 样÷V 样总) ÷T=1688×ΔA÷W

（3）按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟生成 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

SH（nmol/min/104cell）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T=3.376×ΔAV 反总：反应体系总体积，1.05×10-3L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×103L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.05 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，2 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。