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DNA 探针生物素标记试剂盒（PCR法）
【产品名称】DNA 探针生物素标记试剂盒（PCR法）
【包装规格】 5次/盒
【货号】 BES2307115
【预期用途】
用 PCR 对 DNA 进行生物素标记的原理是用带生物素标记的dNTP进行PCR，这些 dNTP 掺入到 PCR 产物中之后，扩增得到的DNA片段自然就带有生物素标记，可以直接用于杂交试验。本产品就是基于上述原理开发，
【它具有下列特点】
1. 一站式，本试剂盒经过精心优化，不需要用户自己摸索标记条件。
2. 优化的生物素掺入率，能有效降低探针中生物素分子之间的可能空间阻碍，检测效果佳。
3. 所得的生物素标记 DNA 探针可以用于 Southern 杂交、Northern杂交、原位杂交、菌落杂交和斑点印迹杂交等分析。
4. 既可用于制备双链 DNA 探针，也可以用于单链DNA 探针。
5. 一次标记反应可以得到 ug 级的生物素标记双链DNA探针或约700ng生物素标记的单链 DNA 探针，足够多次杂交实验用。
6. 本产品足够 5 次非标记 PCR 反应和 5 次生物素标记PCR反应（均指50uL 体系）。
7. 本产品只能用于科研。
【试剂组成】
名 称 | 规 格 |
标记专用 PCR Mix(含酶) | 30μL×1 管 |
dNTP Mix，2.5 mM each | 25ul×1 管 |
含 Biotin-11-dUTP 的dNTP，2.5mM each | 25ul×1 管 |
超纯水 | 1ml×1 管 |
说明书 | 1 份 |
说明：1)不同批号的试剂盒组分不可交互使用。
2）试剂盒内各试剂组份足够包装规格所标示的检测次数。
【储存条件及有效期】
低温运输，-20℃保存，有效期一年。
【适用仪器】
【自备】 DNA 模板和模板专一性引物。
【使用方法】一：准备工作
1. 按常规的方法设计 PCR 引物，使 PCR 产物（探针）长度在400-800bp之间。过短则生物素标记掺入少，探针杂交信号强度减弱；过长则非特异杂交增加，背景变强。
2. 为保证成功率，最好先用常规 PCR 产物制备DNA 片段，再以之为模板进行标记 PCR 反应。不推荐以基因组 DNA 或其他背景复杂的DNA为模板直接进行 PCR 标记反应。
二：用常规 PCR 制备模板
3. 用自备的 PCR 试剂盒按下表设置 50uL 的常规PCR反应以制备标记PCR 模板：
成份 | 加入量 |
自备的 2×PCR Mix（含酶，含 dNTP） | 25 uL |
引物一和引物二（10 pmol/uL） | 各5 uL |
1 ug 基因组 DNA 或 1ng 质粒 DNA | 1 uL |
超纯水 | 补到50uL |
4. 按引物 Tm 值设计的 PCR 参数进行常规PCR。
5. 用自备胶回收试剂盒回收常规 PCR 产物并定量。胶回收步骤可以去残留引物，避免这些引物对后续的标记 PCR 反应的干扰。
三：标记 PCR 反应
注意：由于双链 PCR 探针在杂交时变性的双链彼此还会复性，降低杂交效率，因此强烈推荐使用单链标记 PCR。在设置标记PCR时必须做一个常规 PCR 对照（本试剂盒足够 5 次标记PCR 和5 次常规PCR对照）。
成份 | 标记PCR | 常规PCR |
标记专用 PCR Mix（含酶） | 6 uL | 6uL |
含 Biotin-11-dUTP 的 dNTP, 2.5mM each | 5 uL | 不加 |
dNTP Mix，2.5 mM each | 不加 | 5uL |
若双链标记，加引物一和引物二 若单链标记，只加一条引物 | 各50 pmol | 各50pmol |
胶纯化所得 PCR 产物 | 10 ng（对双链标记） 100ng（对单链标记） | 10ng（对双链标记） 100ng（对单链标记） |
超纯水 | 补到50 uL | 补到50uL |
6. 由于此步所用的 PCR 引物和第 3 步的 PCR 引物完全一样，故可以参考第 3 步 PCR 参数进行标记 PCR，但需要进行下列修改：一是循环数增加到 35-55 个循环，使扩增得到的探针 DNA 片段参差不齐，杂交时这种DNA 能形成网络结构，杂交效果比长度整齐的DNA 更好；二是延伸步骤的时间增加 15 秒，因为标记 dUTP 掺入到DNA 的速度比常规的dTTP慢，增加延伸步骤的时间可以保证更多的标记dUTP 掺入到合成的DNA探针中；三是降低复性温度 5-7℃，因为标记核苷酸参入到DNA后，含标记核苷酸的 DNA 的 Tm 值将比正常的DNA 降低。
7. PCR 结束后，取标记 PCR 反应液和对照反应液3-5 uL 进行琼脂糖凝胶电泳（一定要使用浓度已知的 DNA marker），检测标记是否成功。由于标记 DNA 含有额外的标记物、分子量更大，其泳动速度将慢于常规PCR产物。下图是一个典型的双链标记 PCR 产物和常规PCR产物电泳速度差异的比较图：
8. 探针的定量：电泳所用的 DNA marker 浓度已知（如果不确定，可以问供应商），上样体积已知，故上样量已知，就可通过双链探针DNA和DNAmarker 对应条带的相对亮度来估计探针DNA 浓度。例如，如果探针长度为 500bp，而 marker 中 500bp 这条带的浓度是10ng/uL，共上样10uL，则 500bp 这条带的上样量为 100ng。标记的探针DNA在紫外下亮度只有它的一半，则探针 DNA 的上样量为100/2=50ng，如果上样量是 5uL，则探针的浓度是 50/5=10ng/uL。但是，如果制备的是单链 DNA 探针，则不能按此法估计浓度，因为单链DNA结合核酸染料（如EB 和 SYBR Green I）的能力远低于双链DNA。但可以采用银染法定量（跟 marker 比较）。一般 100ng 模板经单链标记PCR扩增可得到700ng 左右单链探针。
9. 单链 PCR 标记产物可以不经过纯化直接加入到杂交液中，双链PCR标记产物需要加热到 95-100℃ 5 分钟变性然后放冰上急冷后再加入到杂交液中使用。
10.如果探针不立即使用，需要放-20℃长期保存，不能放常温保存，否则TaqDNA 酶的残留的外切酶活性会降解探针 DNA。如果需要纯化探针DNA，请使用乙酸铵/乙醇沉淀法纯化（参考分子克隆手册）。